本文選題：血管生成素相關蛋白-4（angiopoitin-like + protein4）��； 參考：《大連醫(yī)科大學》2013年博士論文

【摘要】：目的：重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis, SAP）具有發(fā)病急劇，病情兇險等特點，早期即可出現急性肺損傷（acute lung injury, ALI）并導致死亡。而其確切的發(fā)病機制較為復雜，有研究報道以細胞因子和炎癥介質的過度釋放而引起的肺微血管內皮細胞通透性增加導致的肺水腫是急性肺損傷的主要病理改變。因此，肺微血管內皮細胞的通透性的改變及其機制探討尤為重要。血管生成素樣蛋白4（Angptl4）是一個重要的調節(jié)糖代謝、脂代謝和胰島素敏感性的蛋白,目前被確定為過氧化物體增殖體激活受體γ血管生成素相關蛋白（PPAR-γ）的靶基因。目前的資料顯示，Angptl4基因除了參與脂肪脂質代謝外，其在腫瘤方面的作用的研究較多，但關于Angptl4在炎癥反應中的作用特別是其在重癥急性胰腺炎導致的肺損傷中的作用的研究鮮有報道。 由于SAP誘發(fā)ALI的機制復雜，涉及到胰酶激活、過氧化損傷、全身炎癥反應、內毒素血癥等多個方面，故目前尚未有一種特效的治療方法，綜合治療方法仍為首選。有研究發(fā)現，Angptl4基因在全身炎癥反應中可能對集體具有保護性作用。本課題通過觀察Angptl4在重癥急性胰腺炎大鼠肺組織及肺微血管內皮細胞上的表達變化，以及應用藥物干預及轉染技術觀察其在炎癥反應過程中的自身變化及對下游炎癥因子的影響。本實驗試圖從急性胰腺炎肺損傷的動物模型及更直接的向肺微血管內皮細胞中轉染Angptl4基因以致其高表達，并應用脂多糖刺激，觀察其變化特點，及炎癥因子和細胞形態(tài)的改變。旨在從更全面的新角度探討SAP誘發(fā)ALI的發(fā)病機制，為有效防治急性胰腺炎肺損傷提供新的方法和實驗依據。 方法：實驗一：健康雄性（Spraghe-Dawley，SD)大鼠32只，體重180g-220g，隨機分為4組:假手術組(CON), SAP模型組(SAP)，羅格列酮治療組(ROSI/ROZ)，GW9662治療組(GW9662)每組8只。SAP動物模型采用1.5%的去氧膽酸鈉溶液(lml/kg)逆行胰膽管注射法。羅格列酮治療組（劑量:5mg/kg）及GW9662治療組（劑量5mg/kg）于造模后10分鐘立即靜脈注射藥物一次。假手術組開腹后，僅輕翻動胰腺后關腹。模型建立24h后，各組大鼠麻醉后開腹，取胰腺、肺組織及動靜脈采血。觀察胰腺和肺組織的病理改變，采用全自動生化分析儀行血氣分析，并對血淀粉酶的含量進行測定，雙抗體夾心法(enzyme linked immuno sorbent assay，ELISA)檢測血清TNF-α和RAF-1含量，采用反轉錄-聚合酶鏈式反應法（RT-PCR）測定肺組織中Angptl4和PPAR-γmRNA的表達，Western-Blot法測定肺組織中Angptl4和PPAR-γ蛋白的表達。HE染色法觀察肺組織及胰腺組織的病理改變，免疫組化法檢測肺微血管壁上VEGF的表達和胰腺細胞的BCL-2的表達。 實驗二：應用Pricells公司提供的大鼠肺微血管內皮細胞系、經鑒定后，于第三代開始用于實驗。培養(yǎng)大鼠肺微血管內皮細胞后將其分為4組：正常組，LPS（100ng/mL）刺激組，LPS+羅格列酮（50g/mL）組，LPS+GW9662（50g/mL）組，藥物作用24h后，以Realtime-PCR和Western bloting法檢測肺微血管內皮細胞中Angptl4的表達。應用脂多糖LPS（100ng/ml）分別刺激大鼠肺微血管內皮細胞6h,12h,24h,以MTT檢測法觀察細胞存活情況，并應用羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色標記細胞骨架F-actin蛋白，觀察大鼠肺微血管內皮細胞的形態(tài)結構學改變。 實驗三：基于實驗一與實驗二，使用美國Sourcebioscience公司提供的大鼠Angptl4基因為模板，通過重組構建pcDNA3.1-eGFP-Angptl4質粒，用于轉染大鼠肺微血管內皮細胞。轉染48h后經LPS作用24h，以Realtime-PCR和Westernbloting法檢測肺微血管內皮細胞中Angptl4表達變化。培養(yǎng)大鼠肺微血管內皮細胞后將其分為8組：正常組，LPS（100ng/mL）刺激組，LPS+羅格列酮（50g/mL）組，LPS+GW9662（50g/mL）組，pcDNA3.1 eGFP組，pcDNA3.1 Angptl4-eGFP組，LPS+pcDNA3.1-eGFP組，LPS+pcDNA3.1-Angptl4-eGFP組。Western bloting法檢測細胞信號通路上的p-MEK1/2, p-AKT/AKT, Bax, casapase8,9蛋白的變化，并ELISA法檢測TNF-α含量變化。再次應用羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色標記細胞骨架F-actin蛋白，觀察大鼠肺微血管內皮細胞的形態(tài)結構學改變。 結果：1．實驗一：與假手術組相比，SAP組血清淀粉酶、TNF-α含量、肺組織中Angptl4mRNA和蛋白表達水平明顯增高，而PPAR-γmRNA基因和蛋白的表達卻明顯降低，胰、肺組織病理損傷明顯，具有明顯的統計學意義（P0.05）。與SAP組相比羅格列酮藥物干預組的胰、肺病理損傷較輕，血清淀粉酶及TNF-α和RAF-1含量降低，肺組織Angptl4和PPAR-γ表達水平明顯上升，肺血管內皮細胞上的VEGF和胰腺腺泡上的BCL-2明顯受抑制。而GW9662干預組卻不同程度降低，具有顯著的統計學意義（P0.05）。 2．實驗二：CD31抗體鑒別原代大鼠肺微血管內皮細胞。LPS組（100ng/mL）刺激24h后Angptl4蛋白表達增加，而同樣應用Angptl4促進劑羅格列酮后，Angptl4蛋白表達增加明顯（P0.01）。并且LPS組培養(yǎng)基的TNF-α水平升高。而應用羅格列酮后TNF-α水平下降明顯，具有顯著差異（P0.01）。而單純應用LPS刺激后，24h細胞減少達到高峰。羅格列酮組細胞存活率明顯高于GW9662組。（P0.01）羅丹明-鬼筆環(huán)肽和DAPI分別染色細胞骨架F-actin和細胞核后，激光共聚焦顯微鏡下觀察單純LPS刺激組，細胞核周圍的胞骨架解聚，而羅格列酮應用組的細胞核中央部分解聚明顯減少，細胞形態(tài)穩(wěn)定。（P0.05） 3．實驗三：pcDNA3.1-eGFP-Angptl4質粒轉染48小時后Realtime-PCR和Westernbloting檢測肺微血管內皮細胞中Angptl4表達明顯比pcDNA3.1-eGFP轉染組增加。（P0.01）與實驗一、二的結果一致，LPS（100ng/mL）刺激后，肺微血管內皮細胞存活率隨時間增加而減少，24h達到高峰（P0.01）轉染目的基因后，大鼠肺微血管內皮細胞存活延長。凋亡通路的促凋亡因子Bax蛋白與casapase8,9蛋白在LPS組明顯增加，而在應用羅格列酮組與轉染目的基因組明顯降低（P0.01）。LPS+pcDNA3.1-eGFP-Angptl4組凋亡通路上的調節(jié)蛋白p-AKT/AKT和p-mek1/2蛋白明顯下調。羅丹明-鬼筆環(huán)肽和DAPI分別染色細胞骨架F-actin和細胞核后，激光共聚焦顯微鏡下觀察轉染目的組的細胞核中央部分解聚明顯減少，細胞形態(tài)穩(wěn)定。（P0.05） 結論：Angptl4是在正常的肺微血管內皮細胞低表達的一種分泌性蛋白，其功能是參與脂質及脂肪的代謝，Angptl4對細胞膜的通透性影響較大，所以其對肺微血管內皮細胞的穩(wěn)定尤其重要。實驗一的結果得出，隨著胰腺炎肺損傷的出現、肺水腫的加重，肺組織Angptl4的mRNA表達和蛋白表達水平上調，說明了Angptl4參與了急性炎癥反應。而其上游基因PPAR-γ的降低，反應了Angptl4參與的炎癥反應并不是直接單靠上游靶基因PPAR-γ的影響。實驗二的模仿急性肺損傷的細胞實驗結果與動物實驗一致，應用羅格列酮藥物可以減輕LPS刺激肺微血管內皮細胞導致的肺損傷。實驗三進一步應用轉染Angptl4基因，觀察其對肺微血管內皮細胞的保護作用及在炎癥損傷情況下對炎癥因子的影響作用。 SAP誘發(fā)ALI的發(fā)病機制較為復雜，目前研究多認為是由于炎癥介質和細胞因子的過度釋放，增加了肺微血管內皮細胞的通透性而發(fā)生的肺水腫，因此本文選擇肺微血管內皮細胞作為靶細胞進行研究。在炎癥反應過程中TNF-α是重要的介質之一，它的出現及表達水平高低可被作為SAP預后的標準。而本實驗結果SAP組與LPS組血清和培養(yǎng)基中的TNF-α升高，肺水腫加重，炎癥反應加重。而羅格列酮的應用Angptl4在肺組織中的表達上調，說明Angptl4的水平與炎癥因子TNF-α的變化成反比。同樣轉染增加了Angptl4的表達后抑制TNF-α的通路上的p-AKT/AKT的表達，減少炎癥因子的生成。并且抑制p-mek1/2表達，影響了細胞骨架的F-actin的解聚，抑制細胞收縮，維持細胞形態(tài)，減少炎癥因子的進一步滲出；抑制促凋亡因子casapase8,9和Bax的生成，拮抗了肺微血管內皮細胞的凋亡。 因此我們推測，Angptl4是炎癥反應時的一種正性蛋白，它的增加能干預炎癥因子的生成，并且維持肺微血管內皮細胞形態(tài)的穩(wěn)定，對抗炎癥反應導致的細胞凋亡，，保護肺功能從而減輕SAP誘發(fā)的ALI，為SAP時ALI的防治提供新的的思路和方法。
[Abstract]:Objective : To study the role of Angptl4 gene in the pathogenesis of acute lung injury ( ALI ) .

In this study , it was found that Angptl4 gene might have protective effect on lung tissue and pulmonary microvascular endothelial cells in rats with severe acute pancreatitis , and the changes of inflammatory factors and cellular morphology were observed .

Methods : Thirty - two healthy male Sprague - Dawley ( SD ) rats weighing 180 g - 220g were randomly divided into 4 groups : sham operation group ( CON ) , SAP model group ( SAP ) , roger treatment group ( ROSI / ROZ ) and GW9662 treatment group ( GW9662 ) .

AIM : To observe the expression of Angptl4 in lung microvascular endothelial cells by using lipopolysaccharide ( LPS ) ( 100 ng / ml ) .

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本文編號：2060085