本文選題：血管生成素相關(guān)蛋白-4（angiopoitin-like + protein4）�。� 參考：《大連醫(yī)科大學(xué)》2013年博士論文

【摘要】：目的：重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis, SAP）具有發(fā)病急劇，病情兇險(xiǎn)等特點(diǎn)，早期即可出現(xiàn)急性肺損傷（acute lung injury, ALI）并導(dǎo)致死亡。而其確切的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，有研究報(bào)道以細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的過(guò)度釋放而引起的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加導(dǎo)致的肺水腫是急性肺損傷的主要病理改變。因此，肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性的改變及其機(jī)制探討尤為重要。血管生成素樣蛋白4（Angptl4）是一個(gè)重要的調(diào)節(jié)糖代謝、脂代謝和胰島素敏感性的蛋白,目前被確定為過(guò)氧化物體增殖體激活受體γ血管生成素相關(guān)蛋白（PPAR-γ）的靶基因。目前的資料顯示，Angptl4基因除了參與脂肪脂質(zhì)代謝外，其在腫瘤方面的作用的研究較多，但關(guān)于A(yíng)ngptl4在炎癥反應(yīng)中的作用特別是其在重癥急性胰腺炎導(dǎo)致的肺損傷中的作用的研究鮮有報(bào)道。 由于SAP誘發(fā)ALI的機(jī)制復(fù)雜，涉及到胰酶激活、過(guò)氧化損傷、全身炎癥反應(yīng)、內(nèi)毒素血癥等多個(gè)方面，故目前尚未有一種特效的治療方法，綜合治療方法仍為首選。有研究發(fā)現(xiàn)，Angptl4基因在全身炎癥反應(yīng)中可能對(duì)集體具有保護(hù)性作用。本課題通過(guò)觀(guān)察Angptl4在重癥急性胰腺炎大鼠肺組織及肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)變化，以及應(yīng)用藥物干預(yù)及轉(zhuǎn)染技術(shù)觀(guān)察其在炎癥反應(yīng)過(guò)程中的自身變化及對(duì)下游炎癥因子的影響。本實(shí)驗(yàn)試圖從急性胰腺炎肺損傷的動(dòng)物模型及更直接的向肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Angptl4基因以致其高表達(dá)，并應(yīng)用脂多糖刺激，觀(guān)察其變化特點(diǎn)，及炎癥因子和細(xì)胞形態(tài)的改變。旨在從更全面的新角度探討SAP誘發(fā)ALI的發(fā)病機(jī)制，為有效防治急性胰腺炎肺損傷提供新的方法和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：實(shí)驗(yàn)一：健康雄性（Spraghe-Dawley，SD)大鼠32只，體重180g-220g，隨機(jī)分為4組:假手術(shù)組(CON), SAP模型組(SAP)，羅格列酮治療組(ROSI/ROZ)，GW9662治療組(GW9662)每組8只。SAP動(dòng)物模型采用1.5%的去氧膽酸鈉溶液(lml/kg)逆行胰膽管注射法。羅格列酮治療組（劑量:5mg/kg）及GW9662治療組（劑量5mg/kg）于造模后10分鐘立即靜脈注射藥物一次。假手術(shù)組開(kāi)腹后，僅輕翻動(dòng)胰腺后關(guān)腹。模型建立24h后，各組大鼠麻醉后開(kāi)腹，取胰腺、肺組織及動(dòng)靜脈采血。觀(guān)察胰腺和肺組織的病理改變，采用全自動(dòng)生化分析儀行血?dú)夥治觯?duì)血淀粉酶的含量進(jìn)行測(cè)定，雙抗體夾心法(enzyme linked immuno sorbent assay，ELISA)檢測(cè)血清TNF-α和RAF-1含量，采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（RT-PCR）測(cè)定肺組織中Angptl4和PPAR-γmRNA的表達(dá)，Western-Blot法測(cè)定肺組織中Angptl4和PPAR-γ蛋白的表達(dá)。HE染色法觀(guān)察肺組織及胰腺組織的病理改變，免疫組化法檢測(cè)肺微血管壁上VEGF的表達(dá)和胰腺細(xì)胞的BCL-2的表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)二：應(yīng)用Pricells公司提供的大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞系、經(jīng)鑒定后，于第三代開(kāi)始用于實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞后將其分為4組：正常組，LPS（100ng/mL）刺激組，LPS+羅格列酮（50g/mL）組，LPS+GW9662（50g/mL）組，藥物作用24h后，以Realtime-PCR和Western bloting法檢測(cè)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞中Angptl4的表達(dá)。應(yīng)用脂多糖LPS（100ng/ml）分別刺激大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞6h,12h,24h,以MTT檢測(cè)法觀(guān)察細(xì)胞存活情況，并應(yīng)用羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色標(biāo)記細(xì)胞骨架F-actin蛋白，觀(guān)察大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)學(xué)改變。 實(shí)驗(yàn)三：基于實(shí)驗(yàn)一與實(shí)驗(yàn)二，使用美國(guó)Sourcebioscience公司提供的大鼠Angptl4基因?yàn)槟０�，通過(guò)重組構(gòu)建pcDNA3.1-eGFP-Angptl4質(zhì)粒，用于轉(zhuǎn)染大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48h后經(jīng)LPS作用24h，以Realtime-PCR和Westernbloting法檢測(cè)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞中Angptl4表達(dá)變化。培養(yǎng)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞后將其分為8組：正常組，LPS（100ng/mL）刺激組，LPS+羅格列酮（50g/mL）組，LPS+GW9662（50g/mL）組，pcDNA3.1 eGFP組，pcDNA3.1 Angptl4-eGFP組，LPS+pcDNA3.1-eGFP組，LPS+pcDNA3.1-Angptl4-eGFP組。Western bloting法檢測(cè)細(xì)胞信號(hào)通路上的p-MEK1/2, p-AKT/AKT, Bax, casapase8,9蛋白的變化，并ELISA法檢測(cè)TNF-α含量變化。再次應(yīng)用羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色標(biāo)記細(xì)胞骨架F-actin蛋白，觀(guān)察大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)學(xué)改變。 結(jié)果：1．實(shí)驗(yàn)一：與假手術(shù)組相比，SAP組血清淀粉酶、TNF-α含量、肺組織中Angptl4mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯增高，而PPAR-γmRNA基因和蛋白的表達(dá)卻明顯降低，胰、肺組織病理?yè)p傷明顯，具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。與SAP組相比羅格列酮藥物干預(yù)組的胰、肺病理?yè)p傷較輕，血清淀粉酶及TNF-α和RAF-1含量降低，肺組織Angptl4和PPAR-γ表達(dá)水平明顯上升，肺血管內(nèi)皮細(xì)胞上的VEGF和胰腺腺泡上的BCL-2明顯受抑制。而GW9662干預(yù)組卻不同程度降低，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 2．實(shí)驗(yàn)二：CD31抗體鑒別原代大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞。LPS組（100ng/mL）刺激24h后Angptl4蛋白表達(dá)增加，而同樣應(yīng)用Angptl4促進(jìn)劑羅格列酮后，Angptl4蛋白表達(dá)增加明顯（P0.01）。并且LPS組培養(yǎng)基的TNF-α水平升高。而應(yīng)用羅格列酮后TNF-α水平下降明顯，具有顯著差異（P0.01）。而單純應(yīng)用LPS刺激后，24h細(xì)胞減少達(dá)到高峰。羅格列酮組細(xì)胞存活率明顯高于GW9662組。（P0.01）羅丹明-鬼筆環(huán)肽和DAPI分別染色細(xì)胞骨架F-actin和細(xì)胞核后，激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察單純LPS刺激組，細(xì)胞核周?chē)陌羌芙饩�，而羅格列酮應(yīng)用組的細(xì)胞核中央部分解聚明顯減少，細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定。（P0.05） 3．實(shí)驗(yàn)三：pcDNA3.1-eGFP-Angptl4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48小時(shí)后Realtime-PCR和Westernbloting檢測(cè)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞中Angptl4表達(dá)明顯比pcDNA3.1-eGFP轉(zhuǎn)染組增加。（P0.01）與實(shí)驗(yàn)一、二的結(jié)果一致，LPS（100ng/mL）刺激后，肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞存活率隨時(shí)間增加而減少，24h達(dá)到高峰（P0.01）轉(zhuǎn)染目的基因后，大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞存活延長(zhǎng)。凋亡通路的促凋亡因子Bax蛋白與casapase8,9蛋白在LPS組明顯增加，而在應(yīng)用羅格列酮組與轉(zhuǎn)染目的基因組明顯降低（P0.01）。LPS+pcDNA3.1-eGFP-Angptl4組凋亡通路上的調(diào)節(jié)蛋白p-AKT/AKT和p-mek1/2蛋白明顯下調(diào)。羅丹明-鬼筆環(huán)肽和DAPI分別染色細(xì)胞骨架F-actin和細(xì)胞核后，激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察轉(zhuǎn)染目的組的細(xì)胞核中央部分解聚明顯減少，細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定。（P0.05） 結(jié)論：Angptl4是在正常的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞低表達(dá)的一種分泌性蛋白，其功能是參與脂質(zhì)及脂肪的代謝，Angptl4對(duì)細(xì)胞膜的通透性影響較大，所以其對(duì)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的穩(wěn)定尤其重要。實(shí)驗(yàn)一的結(jié)果得出，隨著胰腺炎肺損傷的出現(xiàn)、肺水腫的加重，肺組織Angptl4的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)水平上調(diào)，說(shuō)明了Angptl4參與了急性炎癥反應(yīng)。而其上游基因PPAR-γ的降低，反應(yīng)了Angptl4參與的炎癥反應(yīng)并不是直接單靠上游靶基因PPAR-γ的影響。實(shí)驗(yàn)二的模仿急性肺損傷的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)一致，應(yīng)用羅格列酮藥物可以減輕LPS刺激肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致的肺損傷。實(shí)驗(yàn)三進(jìn)一步應(yīng)用轉(zhuǎn)染Angptl4基因，觀(guān)察其對(duì)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及在炎癥損傷情況下對(duì)炎癥因子的影響作用。 SAP誘發(fā)ALI的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前研究多認(rèn)為是由于炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的過(guò)度釋放，增加了肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性而發(fā)生的肺水腫，因此本文選擇肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞作為靶細(xì)胞進(jìn)行研究。在炎癥反應(yīng)過(guò)程中TNF-α是重要的介質(zhì)之一，它的出現(xiàn)及表達(dá)水平高低可被作為SAP預(yù)后的標(biāo)準(zhǔn)。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果SAP組與LPS組血清和培養(yǎng)基中的TNF-α升高，肺水腫加重，炎癥反應(yīng)加重。而羅格列酮的應(yīng)用Angptl4在肺組織中的表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明Angptl4的水平與炎癥因子TNF-α的變化成反比。同樣轉(zhuǎn)染增加了Angptl4的表達(dá)后抑制TNF-α的通路上的p-AKT/AKT的表達(dá)，減少炎癥因子的生成。并且抑制p-mek1/2表達(dá)，影響了細(xì)胞骨架的F-actin的解聚，抑制細(xì)胞收縮，維持細(xì)胞形態(tài)，減少炎癥因子的進(jìn)一步滲出；抑制促凋亡因子casapase8,9和Bax的生成，拮抗了肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。 因此我們推測(cè)，Angptl4是炎癥反應(yīng)時(shí)的一種正性蛋白，它的增加能干預(yù)炎癥因子的生成，并且維持肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)的穩(wěn)定，對(duì)抗炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，，保護(hù)肺功能從而減輕SAP誘發(fā)的ALI，為SAP時(shí)ALI的防治提供新的的思路和方法。
[Abstract]:Objective : To study the role of Angptl4 gene in the pathogenesis of acute lung injury ( ALI ) .

In this study , it was found that Angptl4 gene might have protective effect on lung tissue and pulmonary microvascular endothelial cells in rats with severe acute pancreatitis , and the changes of inflammatory factors and cellular morphology were observed .

Methods : Thirty - two healthy male Sprague - Dawley ( SD ) rats weighing 180 g - 220g were randomly divided into 4 groups : sham operation group ( CON ) , SAP model group ( SAP ) , roger treatment group ( ROSI / ROZ ) and GW9662 treatment group ( GW9662 ) .

AIM : To observe the expression of Angptl4 in lung microvascular endothelial cells by using lipopolysaccharide ( LPS ) ( 100 ng / ml ) .

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本文編號(hào)：2060085