本文選題：香菇多糖 + 膿毒癥��； 參考：《河北醫(yī)科大學》2016年博士論文

【摘要】：燒傷膿毒癥至今仍是臨床急危重癥病人進入ICU的一個重要原因,并且具有很高的死亡率。燒傷膿毒癥對宿主免疫系統(tǒng)的影響是通過多重機制實現(xiàn)的,包括輔助性T細胞穩(wěn)態(tài)失衡,CD4+T淋巴細胞凋亡增加,CD4+CD25+調節(jié)性T細胞凋亡減少及細胞因子譜改變等,同時巨噬細胞的功能障礙在膿毒血癥等相關炎癥反應過程中扮演著重要的角色。香菇多糖是從香菇中提取出的一種能夠調節(jié)人體免疫及抗癌的藥物。研究表明香菇多糖也可以通過強化先天和獲得性免疫反應增強宿主的抗感染作用。巨噬細胞和T淋巴細胞是香菇多糖免疫刺激作用的主要效應細胞。然而,關于香菇多糖與膿毒血癥的治療效果及作用機制尚未完全闡明。本研究通過制作小鼠燒傷膿毒癥模型,探討香菇多糖對燒傷膿毒癥小鼠的存活時間的影響、相關炎癥因子表達、CD4+CD25+調節(jié)性T細胞功能變化,進而研究香菇多糖對小鼠巨噬細胞增殖、凋亡、胞飲能力及相關通路的影響。從而闡明小鼠膿毒癥發(fā)生過程中香菇多糖對其免疫系統(tǒng)的影響及調控機制,從而為改善膿毒癥的預后提供更多的分子依據(jù)。本課題四部分的具體內容如下:第一部分香菇多糖對燒傷膿毒癥小鼠生存率及血清炎性因子影響的研究目的:制備燒傷膿毒癥小鼠模型,觀察膿毒癥小鼠生物學狀況的變化、5天生存率、肝臟形態(tài)病理學變化,血清中IL-1、IL-10和IFN-γ的變化。方法:將128只雄性BALB/c mice小鼠隨機分為燒傷膿毒癥組、低濃度(40 mg/kg)、中濃度(100 mg/kg)和高濃度(250 mg/kg)香菇多糖干預組。在注射香菇多糖1、2、3、4天后分別處死小鼠,采集肝臟和血液樣本,分離血清。觀察膿毒癥小鼠生物學狀況的變化,HE染色法檢測肝臟病理學變化,ELLSA法檢測各組小鼠外周血血清中IL-1、IL-10和IFN-γ的變化。另取60只小鼠處理同前,分組方法同前,用于觀察各組模型小鼠5天生存率。兩組間計量資料采用進行student t分析,多組間比較采用ANOVA,計數(shù)資料采用卡方檢驗,生存分析采用Kaplan-Meier生存曲線法,檢驗水準α=0.05。結果:小鼠術后出現(xiàn)感染癥狀,24 h膿毒癥組出現(xiàn)小鼠5天生存率為6.67%,低,中,高濃度香菇多糖注射組小鼠分別在30h,42h,48h出現(xiàn)死亡,5天生存率分別為33.33%、60%和86.67%。燒傷膿毒癥小鼠5天生存率與香菇多糖劑量呈正相關(r=0.72)。膿毒癥組膿毒癥小鼠肝小葉失去正常結構;肝細胞索解離,可見大面積的肝細胞渾濁腫脹,空泡變性,細胞結構破壞;匯管區(qū)炎癥細胞浸潤,可見紅細胞積聚。再加入香菇多糖后,膿毒癥小鼠的肝小葉結構基本正常;有部分肝細胞變性壞死并伴有少量炎癥細胞浸潤,高濃度(250 mg/kg)組小鼠肝細胞損傷最小,即香菇多糖劑量越高對膿毒癥小鼠肝細胞的損傷越少。低濃度香菇多糖組小鼠外周血中IL-1水平與膿毒癥組相比有升高趨勢,但差異無統(tǒng)計學意義,中高濃度香菇多糖組小鼠外周血中IL-1水平明顯高于膿毒癥組小鼠外周血中IL-1水平,差異具有統(tǒng)計學意義。低濃度香菇多糖組小鼠外周血中IL-10水平在各個時間點均低于膿毒癥組,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);中高濃度香菇多糖組小鼠外周血中IL-10水平明顯低于膿毒癥組,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。低濃度香菇多糖組小鼠外周血中IFN-γ水平與膿毒癥組相比有升高趨勢,但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),中高濃度香菇多糖組小鼠外周血中IFN-γ水平明顯高于膿毒癥組小鼠外周血中IFN-γ水平,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。第二部分香菇多糖對燒傷膿毒癥小鼠CD4+T細胞功能影響的研究目的:探討香菇多糖對CD4+T細胞和CD4+CD25+調節(jié)性T細胞功能的影響及對LPS刺激的CD4+CD25+調節(jié)性T細胞ERK1/2/Fox O1信號通路表達的影響。方法:應用細胞分離試劑盒分離CD4+T細胞和CD4+CD25+調節(jié)性T細胞,應用流式細胞術檢測了膿毒癥組和香菇多糖干預組小鼠外周血中CD4+CD25+Fox P3+調節(jié)性T細胞比例,采用ELISA檢測膿毒癥組和香菇多糖干預組小鼠外周血中CD4+CD25+調節(jié)性T細胞分泌的IL-10;CD4+T細胞分泌的IL-2,IFN-γ及IL-4水平,MTT法檢測CD4+T細胞的活性,實時定量PCR檢測CD4+CD25+Foxp3+T細胞IL-10 m RNA的表達,Western blot檢測CD4+CD25+Fox P3+T細胞中磷酸化ERK1/2和磷酸化Fox O1的表達水平,熒光素酶活性實驗檢測了香菇多糖對Fox O1轉錄活性的影響。計數(shù)資料采用卡方檢驗,兩組間計量資料采用進行student t分析,三組以上比較使用ANOVA分析,檢驗水準α=0.05。結果:1小鼠在造模后的0到3天,CD4+CD25+Fox P3+T細胞所占CD4~+CD25~+T細胞的比例明顯升高,在第3天達到峰值(74.58±8.13%),第4天稍有下降(65.31±6.29%),但是仍然明顯高于第一天,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。低中高劑量香菇多糖治療后各個時間段與模型組相比,Fox P3陽性細胞所占比例均顯著降低。香菇多糖組小鼠外周血CD4+CD25+T細胞分泌的的IL-10水平較同期模型組小鼠IL-10水平明顯降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2香菇多糖處理組的小鼠CD4+T細胞分泌IL-2和IFN-γ的水平呈現(xiàn)上升趨勢,IL-4呈下降趨勢。MTT檢測CD4+T細胞活性顯示,香菇多糖處理組小鼠CD4+T細胞活性增強,且與香菇多糖的濃度相關,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3混合淋巴細胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)來自燙傷合并銅綠假單胞菌感染小鼠的CD·4+CD~25+調節(jié)性T細胞能夠抑制CD4+T對CD3抗體產(chǎn)生的細胞增殖反應,同時IL-4分泌增加,IFN-γ分泌減少。香菇多糖的加入降低IL-4的分泌,提高了IFN-γ的分泌。4與空白CD4~+CD25~+調節(jié)性T細胞相比,加入LPS刺激的CD4~+CD25~+調節(jié)性T細胞IL-10 m RNA表達量升高了3.17倍(P0.05),加入40,100,250ng/ml香菇多糖共刺激組的IL-10 m RNA表達水平與單獨加入LPS組相比,IL-10 m RNA表達量分別下降了17.84%,48.36%,63.59%(P0.05)。LPS刺激的調節(jié)性T細胞加入ERK抑制劑后,與單獨LPS刺激的調節(jié)性T細胞相比,IL-10 m RNA表達量下降了41.53%(P0.05),LPS刺激的調節(jié)性T細胞同時加入ERK抑制劑及香菇多糖后,與單獨加入ERK抑制劑相比,IL-10 m RNA表達量沒有變化(P0.05)。LPS刺激的調節(jié)性T細胞加入p38抑制劑后,與單獨LPS刺激的調節(jié)性T細胞相比,IL-10 m RNA表達量下降了38.19%(P0.05),LPS刺激的調節(jié)性T細胞同時加入p38抑制劑及香菇多糖后,與單獨加入p38抑制劑相比,IL-10m RNA表達量下降了43.27%(P0.05)。LPS加入調節(jié)性T細胞的不同時間點,p-ERK1/2及p-Fox O1表達顯著增高,在15分鐘達到最高峰。加入香菇多糖后的各時間點,p ERK1/2和p Fox O1的表達顯著下降(P0.05)。LPS刺激的調節(jié)性T細胞加入不同劑量(40,100,250ng/ml)香菇多糖后,IL-10啟動子熒光素酶活性與單純LPS刺激的調節(jié)性T細胞相比,分別下降了18.31%,47.51%及62.43%。第三部分香菇多糖對LPS誘導的巨噬細胞RAW264.7活性影響的研究目的:探討香菇多糖對巨噬細胞RAW264.7活性、凋亡、胞飲能力、分泌的NO和TNF-α、及MHC分子表型改變的影響。方法:將RAW264.7細胞在正常條件下培養(yǎng)后,分為三組:PBS組、100 ng/ml LPS組、100 ng/ml香菇多糖和100 ng/ml LPS共培養(yǎng)組。以上三組細胞:MTT檢測LPS刺激后24h,48h,72h的細胞活性;流式細胞法檢測48h后細胞凋亡比率,MHC I及MHC II分子陽性細胞的比率;Western Blot檢測48h后凋亡相關蛋白caspase 3,Bax,Bcl-2的表達;格里斯反應和ELISA方法測定RAW264.7細胞培養(yǎng)液中分泌的NO和TNF-α水平;中性紅染料攝取評價24h后RAW264.7細胞的吞飲活動。統(tǒng)計學方法同第二部分。結果:1加入香菇多糖(100 ng/ml)后細胞的活性與LPS相比顯著增高,48h細胞的活力達到最高峰,為對照組的81.23%(P0.05),此后72h稍有下降,為對照組的74.59%(P0.05);2 LPS處理組細胞凋亡率為31.0%,加入香菇多糖后,細胞凋亡率下降至24.8%,兩組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);3與PBS對照相比,用LPS處理細胞后,促凋亡蛋白(Caspase3和Bax)的表達分別升高了4.62和2.87倍,而抗凋亡蛋白(Bcl-2)表達降低了63.28%,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。而在香菇多糖(100 ng/ml)處理后細胞的促凋亡蛋白(Caspase3和Bax)與LPS相比分別降低了38.39%和52.17%,而抗凋亡蛋白(Bcl-2)表達升高了1.47倍,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);4 PBS對照組NO及TNF-α產(chǎn)生量分別為4.67μg/ml及18.25μg,LPS刺激組為22.59μg/ml及89.59μg/ml,香菇多糖顯著的降低了NO及TNF-α的水平,為12.21μg/ml,52.49μg/ml,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);5 50ng/ml香菇多糖對RAW264.7細胞的胞飲能力沒有顯著影響,100ng/ml香菇多糖能夠顯著促進RAW264.7細胞的吞飲活動,而且呈劑量依賴性;6正常RAW264.7細胞MHC I,MHC II陽性表達率分別為43.36%及7.28%。香菇多糖處理組增強了MHC II分子表達,陽性表達率為27.64%,與正常RAW264.7組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);香菇多糖處理組MHC I分子陽性表達率為40.65%,與正常RAW264.7組相比無統(tǒng)計學差異(P0.05)。第四部分香菇多糖對LPS誘導的巨噬細胞RAW264.7影響機制的研究目的:探討香菇多糖對LPS誘導的巨噬細胞的作用機制是否是通過抑制ERK/NF-κB信號通路實現(xiàn)的。方法:應用RT-PCR和Western blot技術檢測香菇多糖對i NOS m RNA和蛋白的表達;采用熒光素酶報告基因檢測香菇多糖對PBS刺激巨噬細胞組,LPS單獨刺激巨噬細胞組,以及香菇多糖與LPS共刺激巨噬細胞組共計三組細胞NF-κB啟動子活性的影響;Western blot檢測p ERK1/2、p JNK1/2和NF-κB p65的表達。統(tǒng)計學方法同第二部分。結果:1不同濃度香菇多糖,在沒有LPS刺激的情況下,i NOS m RNA和蛋白無表達,100ng/ml LPS能顯著的誘導巨噬細胞RAW 264.7i NOS m RNA和蛋白的表達。與單純的LPS相比,加入20ng/ml,50ng/ml,100ng/ml香菇多糖,i NOS m RNA的表達分別下降了31%,49%和78%,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),i NOS蛋白的表達分別下降了16%,33%和84%,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2與PBS對照組相比,LPS單獨刺激的巨噬細胞RAW 264.7中熒光素酶活性升高了51.27%,而LPS和香菇多糖共刺激條件下熒光素酶活性與LPS相比,下降了27.28%,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),仍顯著高于PBS組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3 p ERK1/2的表達在LPS刺激后的0-6h內的四個時間點逐漸升高。p JNK1/2及核內NF-κB p65表達在LPS刺激后的0.5小時達到高峰,隨后逐漸下降。香菇多糖能顯著降低各時間點p ERK1/2及p JNK1/2的表達,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。在LPS刺激后的0.5小時,香菇多糖并不能降低核內NF-κB p65表達,但是在3小時能顯著降低核內NF-κB p65表達,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論:1香菇多糖通過增強促炎因子IL-1、IFN-γ的表達,降低抗炎因子IL-10的表達,部分恢復燒傷膿毒癥小鼠免疫系統(tǒng)的麻痹或癱瘓狀態(tài),減少小鼠肝臟損傷,從而增加小鼠的生存率。2香菇多糖可以抑制CD4+CD25+Fox P3+調節(jié)性T細胞的ERKFox O1通路,減少IL-10的表達,促進CD4+T細胞的增殖,抑制IL-4表達并促進IL-2和IFN-γ的表達。3香菇多糖可以降低巨噬細胞的凋亡,增強細胞活力、減少NO和TNF-α炎性物質分泌,促進巨噬細胞胞飲能力以及巨噬細胞MHC II分子的表達。4香菇多糖可以抑制i NOS的表達,抑制ERK1/2和JNK1/2的磷酸化,同時抑制NF-κB p65的轉錄活性和核內表達。綜上所述,我們的研究表明香菇多糖可以抑制CD4+CD25+Fox P3+調節(jié)性T細胞的ERK-Fox O1通路,來促進CD4+T細胞向Th1細胞極化;同時香菇多糖可抑制巨噬細胞ERK1/2,JNK1/2,NF-κB通路,促進巨噬細胞活化,從而增強免疫細胞功能,改善膿毒癥小鼠預后。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R644

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 桂明杰;亢學平;王鑫;胡志強;于海茹;張陽;周麗潔;車成來;;香菇多糖對HepG2及H22腫瘤細胞的抑制研究[J];食用菌;2015年05期

2 游如旭;張玉;汪柳;張琪琳;王凱平;;香菇多糖誘導鼠肝癌H_(22)細胞凋亡機制的初步探討[J];中國醫(yī)院藥學雜志;2015年09期

3 王廣成;于健;李爽;;阿德福韋酯聯(lián)合香菇多糖治療慢性乙型肝炎的療效觀察[J];臨床醫(yī)藥文獻電子雜志;2015年11期

4 侯愛萍;張樹梅;;香菇多糖抗菌抗病毒普適性研究[J];藥學研究;2015年04期

5 李國輝;馬紀林;周紅娟;任丹虹;章佳穎;方X;蔡龍;;調節(jié)性T細胞及輔助性T細胞17在嚴重膿毒癥患者中的表達及對預后影響[J];中華危重癥醫(yī)學雜志(電子版);2014年06期

6 李劍萍;路萍;王冬冬;李成光;;香菇多糖聯(lián)合化療治療晚期消化道惡性腫瘤的臨床療效[J];中國藥物經(jīng)濟學;2014年S1期

7 李石軍;王凱平;汪柳;辜明;曾芳;張玉;;香菇多糖LNT_2的提取分離純化、結構及體外抗腫瘤活性研究[J];中草藥;2014年09期

8 Qi Zou;Wei Wen;Xin-chao Zhang;;Presepsin as a novel sepsis biomarker[J];World Journal of Emergency Medicine;2014年01期

9 宋菲;;香菇多糖對雙歧桿菌和大腸桿菌體外生長的影響[J];中國醫(yī)學創(chuàng)新;2013年24期

10 萬健;單怡;張冬青;鄧星奇;單紅衛(wèi);李文放;林兆奮;;膿毒癥小鼠CD4~+ CD25~+ Foxp3~+T細胞變化及其意義[J];中華臨床醫(yī)師雜志(電子版);2012年15期

，

本文編號：2033614