本文選題：TRPM2 + 亞鐵血紅素加氧酶-1　； 參考：《浙江大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：膿毒癥(sepsis)是病原微生物入侵機體引發(fā)的失調(diào)控的全身炎癥反應(yīng),已經(jīng)成為重癥監(jiān)護(hù)病房患者死亡的主要疾病。膿毒癥常并發(fā)器官功能障礙,重癥膿毒癥患者和膿毒癥休克患者病死率高達(dá)30%～50%以上。拮抗脂多糖、調(diào)控炎癥反應(yīng)、抗凝和抗氧化應(yīng)激治療并沒有明顯改善膿毒癥的預(yù)后,觸發(fā)我們重新思考膿毒癥的發(fā)病機制。近年的研究表明免疫抑制在膿毒癥的發(fā)病機制中可能發(fā)揮更重要的作用。在膿毒癥患者中,先天固有免疫和后天獲得性免疫功能發(fā)生嚴(yán)重抑制,免疫細(xì)胞清除入侵病原微生物能力下降,抗生素并不能有效控制體內(nèi)感染灶形成。巨噬細(xì)胞作為機體免疫防御的第一道防線的主要組分,在吞噬清除病原微生物方面發(fā)揮不可替代的功能。近年來國內(nèi)外的研究表明,膿毒癥患者的巨噬細(xì)胞功能發(fā)生嚴(yán)重下降,從而導(dǎo)致細(xì)菌大量繁殖。 瞬時受體電位通道M2(Transient Receptor Potential Melastatin2, TRPM2)是非選擇性鈣離子通道,在巨噬細(xì)胞表面呈固有表達(dá),且脂多糖(LPS)可以明顯上調(diào)其表達(dá)水平。研究表明,TRPM2在巨噬細(xì)胞介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和吞噬病原微生物方面等功能中發(fā)揮重要作用。基因敲除TRPM2可以明顯降低巨噬細(xì)胞炎癥因子的產(chǎn)生和巨噬細(xì)胞的吞噬功能。這些研究提示TRPM2可能通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的功能,從而在膿毒癥的發(fā)病機制中發(fā)揮重要功能。然而,TRPM2在膿毒癥中的作用和機制仍不清楚。 亞鐵血紅素加氧酶-1(Heme oxygenase-1, HO-1)是一種保守的應(yīng)激反應(yīng)酶,在抗炎、抗應(yīng)激反應(yīng)和抗凋亡作用中發(fā)揮重要作用。HO-1還可以增加吞噬細(xì)胞的殺菌能力,在膿毒癥中發(fā)揮重要的保護(hù)作用。近年來的研究表明,鈣離子內(nèi)流對HO-1的表達(dá)有重要影響。因此,我們推測TRPM2介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流可能影響HO-1表達(dá),從而調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的殺菌能力；TRPM2可能通過調(diào)節(jié)HO-1增強殺菌作用在膿毒癥中發(fā)揮一定的保護(hù)作用。 本研究的目的旨在闡述TRPM2對原代體外培養(yǎng)巨噬細(xì)胞殺菌能力的影響和盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)致膿毒癥模型小鼠體內(nèi)細(xì)菌清除及其機制進(jìn)行研究,揭示TRPM2在膿毒癥發(fā)病機制中可能存在的作用。同時,本研究觀察了膿毒癥患者外周血單核細(xì)胞TRPM2和HO-1基因表達(dá)之間相關(guān)性及其對膿毒癥患者預(yù)后的影響。本研究成果將闡明TRPM2在膿毒癥發(fā)生發(fā)展中的作用及機制,完善膿毒癥的發(fā)病機制研究,并為膿毒癥的防治提供新的分子靶點。 第一部分瞬時受體電位通道M2對小鼠巨噬細(xì)胞殺菌能力的影響及其機制研究 目的： 闡明瞬時受體電位通道M2(TRPM2)在巨噬細(xì)胞殺菌功能中的作用,初步探索TRPM2影響巨噬細(xì)胞殺菌功能的可能機制。 方法： 培養(yǎng)并收集TRPM2基因敲除(Trpm2-KO)小鼠和野生型(WT)小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞(BMDMs),100mg/ml終濃度脂多糖(LPS)刺激BMDMs12h,觀察亞鐵血紅素加氧酶-1(Heme oxygenase-1, HO-1)的誘導(dǎo)表達(dá)變化；并采用電生理、細(xì)胞內(nèi)鈣離子(ca2＋)濃度和免疫印跡等檢測,初步探索TRPM2對HO-1表達(dá)影響的機制；使用離體殺菌實驗研究TRPM2對巨噬細(xì)胞殺菌能力的影響和可能機制。 結(jié)果： WT BMDMs在LPS刺激下產(chǎn)生典型特征性的TRPM2電流,而Trpm2-KO BMDMs在LPS刺激下無明顯典型特征性的TRPM2電流產(chǎn)生。LPS刺激12h后,Trpm2-KO BMDMs的HO-1表達(dá)水平顯著低于WT BMDMs (P0.01).鈣離子螯合劑可以劑量依賴性降低LPS刺激WT BMDMs的HO-1表達(dá)。Trpm2-KO BMDMs細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度在LPS刺激后1、2、12和24h顯著低于WT BMDMs. Trpm2-KO BMDMs殺菌能力明顯低于WT BMDMs(P0.05)。HO-1誘導(dǎo)劑Hemin預(yù)處理能顯著增加LPS刺激下WT BMDMs的HO-1表達(dá)并明顯增加WT BMDMs殺菌能力(P0.001)。HO-1誘導(dǎo)劑Hemin預(yù)處理也能顯著增加LPS刺激下Trpm2-KO BMDMs的HO-1表達(dá)并明顯增加Trpm2-KO BMDMs殺菌能力(P0.01)。結(jié)論： TRPM2介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流在LPS刺激巨噬細(xì)胞HO-1的表達(dá)中發(fā)揮重要作用。TRPM2可能是通過調(diào)節(jié)HO-1的表達(dá)影響巨噬細(xì)胞的殺菌能力。 第二部分瞬時受體電位通道M2在膿毒癥中的作用及機制研究 目的： 闡明瞬時受體電位通道M2(TRPM2)在膿毒癥中的作用及其分子機制 方法： 使用盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)膿毒癥小鼠模型,通過對比野生(WT)小鼠和TRPM2基因敲除(Trpm2-KO)小鼠死亡率、細(xì)菌負(fù)荷、器官損傷、全身炎癥反應(yīng)和腹腔巨噬細(xì)胞亞鐵血紅素加氧酶-1(Heme oxygenase-1,HO-1)表達(dá)水平等,明確TRPM2在膿毒癥發(fā)生發(fā)展中的作用。通過觀察HO-1誘導(dǎo)劑對WT小鼠和Trpm2-KO小鼠CLP術(shù)后體內(nèi)細(xì)菌清除率、死亡率、器官損害和全身炎癥反應(yīng)的影響,從而初步明確RPM2可能通過調(diào)控HO-1表達(dá)抑制膿毒癥小鼠體內(nèi)細(xì)菌繁殖并對保護(hù)膿毒癥起到保護(hù)作用。 結(jié)果： Trpm2-KO小鼠7天生存率明顯低于WT小鼠(P0.05)。CLP術(shù)后24h,Trpm2-KO小鼠體內(nèi)細(xì)菌負(fù)荷、器官損害和全身炎癥反應(yīng)均明顯高于WT小鼠。上調(diào)腹腔巨噬細(xì)胞HO-1可以增加WT小鼠CLP術(shù)后殺菌能力。與野生小鼠相比,Trpm2-KO小鼠CLP術(shù)后腹腔巨噬細(xì)胞HO-1的表達(dá)明顯下降(P0.05)。HO-1誘導(dǎo)劑可以顯著增加Trpm2-KO小鼠CLP術(shù)后腹腔巨噬細(xì)胞HO-1的表達(dá)(P0.05),并增強Trpm2-KO小鼠CLP術(shù)后體內(nèi)細(xì)菌清除,從而降低死亡率、全身炎癥反應(yīng)及器官損傷。 結(jié)論： TRPM2可能是通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞HO-1的表達(dá)抑制膿毒癥細(xì)菌繁殖,從而在膿毒癥中發(fā)揮重要的保護(hù)作用。 第三部分瞬時受體電位通道M2和亞鐵血紅素加氧酶-1在膿毒癥病人外周血單核細(xì)胞中的表達(dá) 目的： 測定膿毒癥患者外周血單核細(xì)胞瞬時受體電位通道M2(TRPM2)和亞鐵血紅素加氧酶-1(Heme oxygenase-1, HO-1)基因表達(dá)的水平并分析兩者的相關(guān)性,進(jìn)一步探討TRPM2和HO-1基因表達(dá)水平和患者臨床預(yù)后的相關(guān)性。 方法： 通過分離膿毒癥患者外周血單核細(xì)胞,使用定量PCR檢測TRPM2和HO-1mRNA水平。記錄膿毒癥患者一般資料、APACHE Ⅱ評分、SOFA評分和30天死亡率。 結(jié)果： 重度膿毒癥或膿毒癥休克組和非膿毒癥組病人兩組間年齡、性別和ICU住院時間無明顯差異。重度膿毒癥或膿毒癥休克組APACHE Ⅱ評分(P=0.001),SOFA評分(P0.05)和28天死亡率(P0.05)高于非膿毒癥組。定量PCR結(jié)果顯示非存活膿毒癥患者單核細(xì)胞TRPM2mRNA表達(dá)低于非膿毒癥患者(P0.05)或存活膿毒癥患者(P=0.001)。非存活膿毒癥患者單核細(xì)胞HO-1mRNA表達(dá)也低于非膿毒癥患者(P0.05)或存活膿毒癥患者(P0.05)。存活的膿毒癥患者單核細(xì)胞TRPM2和HO-1mRNA表達(dá)和非膿毒癥患者相比無明顯差異。TRPM2和HO-1m] WA呈現(xiàn)高度相關(guān)性(r=0.675,P=0.001)。 結(jié)論： TRPM2和HO-1基因表達(dá)低的患者更容易死亡。膿毒癥患者單核細(xì)胞TRPM2和HO-1mRNA呈現(xiàn)高度相關(guān)性。
[Abstract]:Abscess ( sepsis ) is the main disease caused by pathogenic microorganism invading the organism . It has become the main disease of death in the intensive care unit . In the patients with sepsis , the mortality of patients with sepsis and septic shock is up to 30 % 锝，

本文編號：2011263