本文選題：重癥急性胰腺炎 + 急性肺損傷��； 參考：《大連醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：目的： 探討缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrixmetalloproteinase-9， MMP-9）在重癥急性胰腺炎（SAP）肺損傷（severe acutepancreatitis-associated lung injury，SAPALI）中的表達(dá)及作用，應(yīng)用中藥單體大黃素干預(yù)脂多糖刺激的肺泡上皮細(xì)胞，觀察HIF-1α以及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）等炎癥因子的變化。用RNA干擾的方法對(duì)肺泡上皮細(xì)胞的HIF-1α進(jìn)行基因沉默，繼續(xù)觀察大黃素干預(yù)的sh-HIF-1α細(xì)胞中上述因子的變化。本實(shí)驗(yàn)旨在進(jìn)一步揭示HIF-1α、MMP-9在重癥急性胰腺炎肺損傷發(fā)病機(jī)制中的作用，探究其在肺泡-毛細(xì)血管屏障功能紊亂和肺水腫發(fā)病中的作用。同時(shí)探討中藥單體大黃素在脂多糖刺激的肺泡上皮細(xì)胞炎癥中所發(fā)揮的作用，尋找治療肺損傷的藥物作用靶點(diǎn)，為臨床治療重癥急性胰腺炎肺損傷提供更多的理論依據(jù)。 方法： 實(shí)驗(yàn)一:將SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（SO組，n=10）、模型組（SAP組，n=10）。假手術(shù)組僅行剖腹術(shù),翻動(dòng)胰腺。模型組采用膽胰管逆行注入5%脫氧膽酸鈉（1ml/kg）建立大鼠重癥急性胰腺炎肺損傷模型。各組動(dòng)物在術(shù)后24h檢測(cè)PaO2、PaCO2以及血淀粉酶。應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)動(dòng)物模型血清中HIF-1α、MMP-9以及TNF-α的活性，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測(cè)肺組織HIF-1α、MMP-9mRNA的表達(dá)強(qiáng)度，采用Western-blot方法檢測(cè)肺組織HIF-1α、MMP-9的表達(dá)，并觀察胰腺、肺組織的病理變化。 實(shí)驗(yàn)二：將SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（SO組，n=10）、模型組（SAP組，n=10）、二甲氧基雌二醇（2-methoxyestradiol，2ME2）小劑量治療組（2ME25mg/kg，n=10）和二甲氧基雌二醇大劑量治療組（2ME215mg/kg，n=10）。假手術(shù)組僅行剖腹術(shù)，翻動(dòng)胰腺。模型組和二甲氧基雌二醇治療組均采用膽胰管逆行注入5%脫氧膽酸鈉（1ml/kg）建立大鼠重癥急性胰腺炎肺損傷模型。二甲氧基雌二醇治療組于造模后1小時(shí)，分別向動(dòng)物模型內(nèi)腹腔注射HIF-1α抑制劑二甲氧基雌二醇5mg/kg，15mg/kg。各組動(dòng)物在術(shù)后24h測(cè)PaO2、PaCO2、血淀粉酶、肺組織伊文思藍(lán)含量以及肺濕干比值。應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)動(dòng)物模型血清中HIF-1α、MMP-9以及TNF-α的活性。應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)肺組織HIF-1α、MMP-9mRNA的表達(dá)強(qiáng)度，采用Western-blot方法檢測(cè)肺組織HIF-1α、MMP-9表達(dá)，并觀察四組胰腺和肺組織病理變化。 實(shí)驗(yàn)三：選用人肺上皮細(xì)胞系（A549）進(jìn)行培養(yǎng)，用低（10μmol/L）、中（20μmol/L）和高（40μmol/L）三個(gè)濃度的大黃素孵育作用后，再用LPS（200ng/ml）進(jìn)行刺激造模，建立模型。應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞活性進(jìn)行測(cè)定。應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)各組中HIF-1α、TNF-α、IL-6mRNA的表達(dá)強(qiáng)度，采用Western-blot方法檢測(cè)上述因子的蛋白表達(dá)。大黃素孵育敲除HIF-1α的A549細(xì)胞系，用LPS刺激細(xì)胞，體外建立細(xì)胞損傷模型。應(yīng)用ELISA檢測(cè)sh-HIF-1α和sh-control兩組中TNF-α、IL-6的活性，采用Western-blot方法檢測(cè)HIF-1α蛋白的表達(dá)。另檢測(cè)大黃素和或干擾HIF-1α條件下LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞系培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6的表達(dá)，尋找大黃素可能的作用機(jī)制。 結(jié)果： SAP模型組PaCO2、肺組織濕干比、伊文思藍(lán)含量以及血淀粉酶高于假手術(shù)組（P0.05），而PaO2低于假手術(shù)組（P0.05）。SAP組HIF-1α、MMP-9mRNA和蛋白表達(dá)較假手術(shù)組顯著升高（P0.05）。SAP組肺組織和胰腺組織病理評(píng)分高于假手術(shù)組病理評(píng)分（P0.05）。應(yīng)用HIF-1α抑制劑二甲氧基雌二醇干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，干預(yù)治療組PaCO2、肺組織濕干比、伊文思藍(lán)含量以及血淀粉酶較SAP組下降，而PaO2較SAP組升高（P0.05），同時(shí)2ME215mg/kg治療組較2ME25mg/kg治療組上述指標(biāo)下降，PaO2升高（P0.05）。ELISA方法檢測(cè)HIF-1α、MMP-9、TNF-α，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2ME2治療組中上述因子的活性較SAP組下降（P0.05），，同時(shí)2ME215mg/kg治療組較2ME25mg/kg治療組上述因子的活性下降更明顯（P0.05），但是MMP-9活性在SAP和二甲氧基雌二醇小劑量治療組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。2ME2治療組中HIF-1α、MMP-9mRNA表達(dá)較SAP組差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，2ME2治療組中HIF-1α蛋白較SAP組下調(diào)，且HIF-1α蛋白在2ME215mg/kg治療組較2ME25mg/kg治療組下降更明顯（P0.05）。MMP-9蛋白表達(dá)在2ME25mg/kg和SAP組中差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），2ME215mg/kg治療組較2ME25mg/kg治療組MMP-9蛋白明顯下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2ME2治療組中的肺組織和胰腺組織的病理評(píng)分較SAP模型組明顯下降，同時(shí)2ME215mg/kg治療組較2ME25mg/kg治療組組織的病理評(píng)分下降更明顯（P0.05）。MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素LPS刺激肺上皮細(xì)胞損傷模型組的細(xì)胞生長(zhǎng)活性較正常組細(xì)胞生長(zhǎng)活性明顯下降，應(yīng)用大黃素治療后發(fā)現(xiàn)，治療組中細(xì)胞的生長(zhǎng)活性較模型組有所上升，并且上升程度呈劑量依賴性（P0.05）。LPS刺激組的HIF-1α、TNF-α、IL-6mRNA表達(dá)強(qiáng)度較正常組升高，應(yīng)用大黃素治療后，上述因子的mRNA表達(dá)情況均下調(diào)，尤以大黃素（40μmol/L）組為甚（P0.05）。Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS刺激組中的HIF-1α蛋白表達(dá)較正常組升高，ELISA結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS刺激組中的TNF-α、IL-6蛋白較正常組升高，應(yīng)用大黃素干預(yù)治療后，上述因子的蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，且大黃素（40μmol/L）組為甚（P0.05）。同時(shí)，我們?cè)诖簏S素處理的同時(shí)干擾HIF-1α的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)IL-6、TNF-α的表達(dá)要明顯低于未處理組、HIF-1α-shRNA組及單純應(yīng)用大黃素組（P0.05），這些結(jié)果說(shuō)明在抑制LPS誘導(dǎo)的A549炎癥介質(zhì)的釋放的過(guò)程中大黃素可能是通過(guò)HIF-1α起作用的，同時(shí)二者在抑制炎癥發(fā)生的過(guò)程中具有協(xié)同作用。 結(jié)論： SAP肺損傷模型中，HIF-1α、MMP-9在肺組織中表達(dá)升高。HIF-1α抑制劑2ME2可以緩解重癥急性胰腺炎肺損傷動(dòng)物模型中肺泡-毛細(xì)血管屏障紊亂和肺水腫的嚴(yán)重程度，HIF-1α和MMP-9在重癥急性胰腺炎肺損傷時(shí)肺泡-毛細(xì)血管屏障功能紊亂和肺水腫發(fā)病環(huán)節(jié)中起重要的作用。另外，大劑量應(yīng)用2ME2可以明顯下調(diào)MMP-9的表達(dá)，說(shuō)明MMP-9與HIF-1α可能在一條炎癥通路上，并且受“炎癥開(kāi)關(guān)”HIF-1α的調(diào)控。體外實(shí)驗(yàn)表明在LPS處理的人肺上皮細(xì)胞肺損傷模型中，中藥單體大黃素可以下調(diào)HIF-1α以及相關(guān)炎癥因子的表達(dá)，且聯(lián)合應(yīng)用大黃素/HIF-1α-shRNA較單用大黃或者HIF-1α-shRNA對(duì)肺泡上皮細(xì)胞起到更強(qiáng)的保護(hù)作用，防止肺損傷的加重和惡化。
[Abstract]:Objective:
To investigate the expression and role of hypoxia inducible factor -1 alpha (hypoxia inducible factor-1 a, HIF-1 alpha), matrix metalloproteinase -9 (matrixmetalloproteinase-9, MMP-9) in severe acute pancreatitis (SAP) lung injury (severe acutepancreatitis-associated lung), and the use of Chinese herbal medicine mono emodin to intervene in the alveoli stimulated by lipopolysaccharide Epithelial cells, observe the changes of HIF-1 A and tumor necrosis factor - alpha (tumor necrosis factor- alpha, TNF- alpha), interleukins -6 (interleukin-6, IL-6) and other inflammatory factors. The gene silencing of HIF-1 alpha in alveolar epithelial cells by RNA interference is used to continue to observe the changes of these factors in the sh-HIF-1 alpha cells intervened by emodin. To further reveal the role of HIF-1 alpha and MMP-9 in the pathogenesis of lung injury in severe acute pancreatitis, explore its role in the dysfunction of the alveolar capillary barrier and the pathogenesis of pulmonary edema, and explore the role of emodin in the inflammation of alveolar epithelial cells stimulated by lipopolysaccharide to find drugs for the treatment of lung injury. Objective to provide more theoretical basis for clinical treatment of severe acute pancreatitis lung injury.
Method錛

本文編號(hào)：1995111