本文選題：TREM-2 + 表達水平��； 參考：《浙江大學》2014年博士論文

【摘要】：第一部分TREM-2在膿毒癥小鼠中的表達及其與膿毒癥發(fā)生發(fā)展的關系 研究目的：TREM-2是一類主要表達于活化的巨噬細胞、屬于免疫球蛋白超家族的細胞表面受體。Ⅱ型細胞因子(如IL-4等)能誘導巨噬細胞TREM-2的表達。TREM-2是包括G+菌、G-菌和酵母菌等在內(nèi)的病原微生物的吞噬受體,TREM-2及其介導的信號通路能明顯減弱巨噬細胞產(chǎn)生與釋放促炎介質(zhì)的能力。因而推測TREM-2可能在膿毒癥的感染和免疫炎癥調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用。因此,本部分研究通過檢測膿毒癥小鼠重要臟器／組織巨噬細胞TREM-2的表達水平,分析細胞TREM-2的表達水平和膿毒癥發(fā)生發(fā)展之間的相關性。 研究方法：采用CLP誘導小鼠膿毒癥模型,以假手術小鼠作為對照組,于術后Oh、6h、12h、24h、72h、120h、168h取小鼠肝臟、肺臟、脾臟和腹腔灌洗液、外周血等。采用免疫組化法檢測肝臟、肺臟和脾臟組織中TREM-2的表達水平,并采用雙重免疫熒光標記法對TREM-2的表達進行細胞定位。采用流式細胞術檢測腹腔巨噬細胞中TREM-2的表達水平,采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)檢測外周血IL-4、IL-13和IL-10濃度,采用瓊脂平板培養(yǎng)法檢測腹腔細菌感染程度。 結(jié)果：膿毒癥小鼠和對照小鼠術后0h各臟器組織均不表達TREM-2。在肝臟、肺臟和脾臟,膿毒癥小鼠CLP術后6h TREM-2表達水平開始增強,并于術后72h到達峰值,之后又呈逐漸下降,而對照組小鼠在各時間點均未檢測到TREM-2表達。雙重免疫熒光標記法證實TREM-2表達于組織巨噬細胞。在腹腔巨噬細胞中,膿毒癥小鼠TREM-2的表達變化與其他臟器一致,而對照組小鼠在術后24h TREM-2表達水平稍有增加,兩組小鼠TREM-2表達水平在術后72h時有顯著性差異(P0.05)。膿毒癥小鼠血漿IL-4濃度在CLP術后24h達峰值,其動態(tài)變化趨勢與TREM-2的表達變化相似,但要早于TREM-2。膿毒癥小鼠腹腔細菌感染在CLP術后逐漸增加,于術后72h感染最嚴重,其動態(tài)變化與TREM-2的表達變化完全一致。但TREM-2的表達變化與血漿IL-13和IL-10的濃度變化無關。結(jié)論：在膿毒癥小鼠中,TREM-2的表達水平呈先增強后減弱的變化特征,于膿毒癥72h后達峰值。TREM-2的表達變化可能與IL-4的誘導性有關,而且可能在膿毒癥感染的免疫防御中發(fā)揮重要作用。 第二部分阻斷TREM-2對膿毒癥發(fā)病的影響 研究目的：鑒于TREM-2在膿毒癥發(fā)病過程中的表達變化特征,因此本部分研究主要探討阻斷內(nèi)源性TREM-2的作用對膿毒癥發(fā)病的影響及機制。研究方法：將CLP誘導的膿毒癥小鼠,隨機分為兩組,在CLP18h后,通過尾靜脈注射的方法分別給予20μg小鼠TREM-2/人IgG1重組蛋白(mTREM-2/IgG1組)和201μg人IgG1重組蛋白(IgG1組),觀察其7天生存率。同時,分別于給予重組蛋白24h、72h和120h后,取腹腔灌洗液和外周血,采用瓊脂平板培養(yǎng)法檢測腹腔細菌感染程度,采用ELISA法檢測腹腔灌洗液和外周血IL-10濃度。 結(jié)果：與IgG1組相比,mTREM-2/IgG1組小鼠7天生存率顯著降低(8.3%vs.50%；P0.05)。給予重組蛋白24h后,兩組小鼠腹腔細菌感染程度無顯著性差異(P0.05)；給予重組蛋白72h和120h后,mTREM-2/IgG1組小鼠腹腔細菌感染均較IgG1組小鼠明顯加重(P0.05)。兩組小鼠腹腔灌洗液和外周血IL-10濃度無顯著性差異。 結(jié)論：阻斷TREM-2的作用降低膿毒癥小鼠的7天生存率,其原因可能與加重膿毒癥小鼠的細菌感染有關。 第三部分重組TREM-2對膿毒癥的保護作用研究研究目的：鑒于TREM-2在膿毒癥中呈誘導性表達,且其表達峰值較遲,而阻斷TREM-2的作用則加重膿毒癥的發(fā)病,因此本部分研究主要探討在膿毒癥發(fā)病早期重組TREM-2對膿毒癥的保護作用及其機制。研究方法：構(gòu)建表達TREM-2的重組腺病毒和對照腺病毒,分別感染BMMC,用Western-blot和流式細胞術分別檢測TREM-2蛋白的表達水平。以高表達TREM-2的BMMC為研究對象,一方面采用激動性抗體激活TREM-2介導的信號通路,并用100ng/ml脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激,觀察重組TREM-2對炎癥反應的影響；另一方面觀察高表達TREM-2的BMMC對熒光顆粒和細菌的吞噬功能。將高表達TREM-2的BMMC于膿毒癥模型誘導后不同時間點(2h、4h、6h)回輸至小鼠體內(nèi),觀察重組TREM-2對膿毒癥小鼠7天生存率的影響。在膿毒癥后2h細胞回輸組,于細胞回輸后24h和48h分別取小鼠外周血、腹腔灌洗液、肝臟、肺臟和脾臟等。采用瓊脂平板培養(yǎng)法檢測全身和局部細菌感染程度,采用ELISA法檢測炎癥因子IL-10濃度,采用組織化學法等觀察臟器形態(tài)功能。結(jié)果：重組腺病毒能在BMMC中高表達TREM-2。激活BMMC中的TREM-2分子,能活化其下游的Akt信號分子,經(jīng)LPS刺激后,顯著增強IL-10mRNA水平。高表達TREM-2的BMMC對熒光顆粒和細菌均有顯著增強的吞噬作用。膿毒癥模型誘導后2h和4h回輸高表達TREM-2的BMMC能明天改善小鼠的7天生存率。在膿毒癥后2h細胞回輸組,細胞回輸24h和48h后小鼠全身和局部細菌負荷量明顯下降,肝臟和肺臟損傷明顯減輕,脾臟細胞凋亡減少,但外周血和腹腔灌洗液中IL-10水平無顯著變化。 結(jié)論：膿毒癥發(fā)病早期增強TREM-2的表達對膿毒癥有保護作用,可有效改善膿毒癥的預后；作用機制與其吞噬清除細菌的功能密切相關。
[Abstract]:Expression of first part TREM - 2 in septic mice and its relationship with sepsis

TREM - 2 ( TREM - 2 ) is a kind of cell surface receptor which is mainly expressed in activated macrophages and belongs to immunoglobulin superfamily . TREM - 2 can induce the expression of TREM - 2 in macrophages . TREM - 2 plays an important role in the regulation of sepsis and immune inflammation . Therefore , it is speculated that TREM - 2 may play an important role in the regulation of sepsis and immune inflammation . Therefore , this part studies the correlation between the expression level of TREM - 2 and the development of sepsis by detecting the expression level of TREM - 2 in the important organ / tissue macrophages of sepsis .

Methods : The expression level of TREM - 2 in liver , lung and spleen was determined by immunohistochemistry . The levels of TREM - 2 in liver , lung and spleen were detected by immunohistochemistry . The levels of TREM - 2 in liver , lung and spleen were detected by immunohistochemistry . The concentration of TREM - 2 was detected by enzyme linked immunosorbent assay ( ELISA ) . The levels of IL - 4 , IL - 13 and IL - 10 in peripheral blood were detected by enzyme linked immunosorbent assay ( ELISA ) .

Results : The expression of TREM - 2 in septic mice was similar to that of TREM - 2 at 72 h after CLP . However , the change of TREM - 2 expression was similar to that of TREM - 2 at 72 h after operation .

The effect of TREM - 2 on the pathogenesis of sepsis

Objective : To investigate the effect and mechanism of blocking endogenous TREM - 2 on sepsis . Methods : After 24 hours , 72 h and 120 h after the administration of recombinant protein , 20 渭g mouse TREM - 2 / human IgG1 recombinant protein ( mTREM - 2 / IgG1 group ) and 20渭g human IgG1 recombinant protein ( IgG1 group ) were randomly divided into two groups .

Results : The 7 - day survival rate of mTREM - 2 / IgG1 group was significantly lower than that of IgG1 group ( 8.3 % vs . 50 % ) .
P0.05). After 24 h of recombinant protein , there was no significant difference between the two groups ( P0.05 ) .
After 72 h and 120 h of recombinant protein , the mice of mTREM - 2 / IgG1 group were significantly higher than those in IgG1 group ( P0.05 ) . There was no significant difference in the concentrations of IL - 10 in peritoneal lavage fluid and peripheral blood in both groups .

Conclusion : Blocking the effects of TREM - 2 on the 7 - day survival rate of septic mice may be related to the bacterial infection in septic mice .

The effect of TREM - 2 on sepsis was studied by Western - blot and flow cytometry .
The effect of recombinant TREM - 2 on 7 - day survival rate of mice was studied by means of agar plate culture .

Conclusion : The early enhancement of TREM - 2 expression in sepsis has protective effect on sepsis , which can effectively improve the prognosis of sepsis .
The mechanism of action is closely related to its phagocytic function .
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R459.7

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本文編號：1933927