本文選題：TREM-2 + 表達(dá)水平�。� 參考：《浙江大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：第一部分TREM-2在膿毒癥小鼠中的表達(dá)及其與膿毒癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)系 研究目的：TREM-2是一類主要表達(dá)于活化的巨噬細(xì)胞、屬于免疫球蛋白超家族的細(xì)胞表面受體。Ⅱ型細(xì)胞因子(如IL-4等)能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞TREM-2的表達(dá)。TREM-2是包括G+菌、G-菌和酵母菌等在內(nèi)的病原微生物的吞噬受體,TREM-2及其介導(dǎo)的信號(hào)通路能明顯減弱巨噬細(xì)胞產(chǎn)生與釋放促炎介質(zhì)的能力。因而推測(cè)TREM-2可能在膿毒癥的感染和免疫炎癥調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮重要作用。因此,本部分研究通過(guò)檢測(cè)膿毒癥小鼠重要臟器／組織巨噬細(xì)胞TREM-2的表達(dá)水平,分析細(xì)胞TREM-2的表達(dá)水平和膿毒癥發(fā)生發(fā)展之間的相關(guān)性。 研究方法：采用CLP誘導(dǎo)小鼠膿毒癥模型,以假手術(shù)小鼠作為對(duì)照組,于術(shù)后Oh、6h、12h、24h、72h、120h、168h取小鼠肝臟、肺臟、脾臟和腹腔灌洗液、外周血等。采用免疫組化法檢測(cè)肝臟、肺臟和脾臟組織中TREM-2的表達(dá)水平,并采用雙重免疫熒光標(biāo)記法對(duì)TREM-2的表達(dá)進(jìn)行細(xì)胞定位。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腹腔巨噬細(xì)胞中TREM-2的表達(dá)水平,采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)檢測(cè)外周血IL-4、IL-13和IL-10濃度,采用瓊脂平板培養(yǎng)法檢測(cè)腹腔細(xì)菌感染程度。 結(jié)果：膿毒癥小鼠和對(duì)照小鼠術(shù)后0h各臟器組織均不表達(dá)TREM-2。在肝臟、肺臟和脾臟,膿毒癥小鼠CLP術(shù)后6h TREM-2表達(dá)水平開(kāi)始增強(qiáng),并于術(shù)后72h到達(dá)峰值,之后又呈逐漸下降,而對(duì)照組小鼠在各時(shí)間點(diǎn)均未檢測(cè)到TREM-2表達(dá)。雙重免疫熒光標(biāo)記法證實(shí)TREM-2表達(dá)于組織巨噬細(xì)胞。在腹腔巨噬細(xì)胞中,膿毒癥小鼠TREM-2的表達(dá)變化與其他臟器一致,而對(duì)照組小鼠在術(shù)后24h TREM-2表達(dá)水平稍有增加,兩組小鼠TREM-2表達(dá)水平在術(shù)后72h時(shí)有顯著性差異(P0.05)。膿毒癥小鼠血漿IL-4濃度在CLP術(shù)后24h達(dá)峰值,其動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)與TREM-2的表達(dá)變化相似,但要早于TREM-2。膿毒癥小鼠腹腔細(xì)菌感染在CLP術(shù)后逐漸增加,于術(shù)后72h感染最嚴(yán)重,其動(dòng)態(tài)變化與TREM-2的表達(dá)變化完全一致。但TREM-2的表達(dá)變化與血漿IL-13和IL-10的濃度變化無(wú)關(guān)。結(jié)論：在膿毒癥小鼠中,TREM-2的表達(dá)水平呈先增強(qiáng)后減弱的變化特征,于膿毒癥72h后達(dá)峰值。TREM-2的表達(dá)變化可能與IL-4的誘導(dǎo)性有關(guān),而且可能在膿毒癥感染的免疫防御中發(fā)揮重要作用。 第二部分阻斷TREM-2對(duì)膿毒癥發(fā)病的影響 研究目的：鑒于TREM-2在膿毒癥發(fā)病過(guò)程中的表達(dá)變化特征,因此本部分研究主要探討阻斷內(nèi)源性TREM-2的作用對(duì)膿毒癥發(fā)病的影響及機(jī)制。研究方法：將CLP誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠,隨機(jī)分為兩組,在CLP18h后,通過(guò)尾靜脈注射的方法分別給予20μg小鼠TREM-2/人IgG1重組蛋白(mTREM-2/IgG1組)和201μg人IgG1重組蛋白(IgG1組),觀察其7天生存率。同時(shí),分別于給予重組蛋白24h、72h和120h后,取腹腔灌洗液和外周血,采用瓊脂平板培養(yǎng)法檢測(cè)腹腔細(xì)菌感染程度,采用ELISA法檢測(cè)腹腔灌洗液和外周血IL-10濃度。 結(jié)果：與IgG1組相比,mTREM-2/IgG1組小鼠7天生存率顯著降低(8.3%vs.50%；P0.05)。給予重組蛋白24h后,兩組小鼠腹腔細(xì)菌感染程度無(wú)顯著性差異(P0.05)；給予重組蛋白72h和120h后,mTREM-2/IgG1組小鼠腹腔細(xì)菌感染均較IgG1組小鼠明顯加重(P0.05)。兩組小鼠腹腔灌洗液和外周血IL-10濃度無(wú)顯著性差異。 結(jié)論：阻斷TREM-2的作用降低膿毒癥小鼠的7天生存率,其原因可能與加重膿毒癥小鼠的細(xì)菌感染有關(guān)。 第三部分重組TREM-2對(duì)膿毒癥的保護(hù)作用研究研究目的：鑒于TREM-2在膿毒癥中呈誘導(dǎo)性表達(dá),且其表達(dá)峰值較遲,而阻斷TREM-2的作用則加重膿毒癥的發(fā)病,因此本部分研究主要探討在膿毒癥發(fā)病早期重組TREM-2對(duì)膿毒癥的保護(hù)作用及其機(jī)制。研究方法：構(gòu)建表達(dá)TREM-2的重組腺病毒和對(duì)照腺病毒,分別感染BMMC,用Western-blot和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)TREM-2蛋白的表達(dá)水平。以高表達(dá)TREM-2的BMMC為研究對(duì)象,一方面采用激動(dòng)性抗體激活TREM-2介導(dǎo)的信號(hào)通路,并用100ng/ml脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激,觀察重組TREM-2對(duì)炎癥反應(yīng)的影響；另一方面觀察高表達(dá)TREM-2的BMMC對(duì)熒光顆粒和細(xì)菌的吞噬功能。將高表達(dá)TREM-2的BMMC于膿毒癥模型誘導(dǎo)后不同時(shí)間點(diǎn)(2h、4h、6h)回輸至小鼠體內(nèi),觀察重組TREM-2對(duì)膿毒癥小鼠7天生存率的影響。在膿毒癥后2h細(xì)胞回輸組,于細(xì)胞回輸后24h和48h分別取小鼠外周血、腹腔灌洗液、肝臟、肺臟和脾臟等。采用瓊脂平板培養(yǎng)法檢測(cè)全身和局部細(xì)菌感染程度,采用ELISA法檢測(cè)炎癥因子IL-10濃度,采用組織化學(xué)法等觀察臟器形態(tài)功能。結(jié)果：重組腺病毒能在BMMC中高表達(dá)TREM-2。激活BMMC中的TREM-2分子,能活化其下游的Akt信號(hào)分子,經(jīng)LPS刺激后,顯著增強(qiáng)IL-10mRNA水平。高表達(dá)TREM-2的BMMC對(duì)熒光顆粒和細(xì)菌均有顯著增強(qiáng)的吞噬作用。膿毒癥模型誘導(dǎo)后2h和4h回輸高表達(dá)TREM-2的BMMC能明天改善小鼠的7天生存率。在膿毒癥后2h細(xì)胞回輸組,細(xì)胞回輸24h和48h后小鼠全身和局部細(xì)菌負(fù)荷量明顯下降,肝臟和肺臟損傷明顯減輕,脾臟細(xì)胞凋亡減少,但外周血和腹腔灌洗液中IL-10水平無(wú)顯著變化。 結(jié)論：膿毒癥發(fā)病早期增強(qiáng)TREM-2的表達(dá)對(duì)膿毒癥有保護(hù)作用,可有效改善膿毒癥的預(yù)后；作用機(jī)制與其吞噬清除細(xì)菌的功能密切相關(guān)。
[Abstract]:Expression of first part TREM - 2 in septic mice and its relationship with sepsis

TREM - 2 ( TREM - 2 ) is a kind of cell surface receptor which is mainly expressed in activated macrophages and belongs to immunoglobulin superfamily . TREM - 2 can induce the expression of TREM - 2 in macrophages . TREM - 2 plays an important role in the regulation of sepsis and immune inflammation . Therefore , it is speculated that TREM - 2 may play an important role in the regulation of sepsis and immune inflammation . Therefore , this part studies the correlation between the expression level of TREM - 2 and the development of sepsis by detecting the expression level of TREM - 2 in the important organ / tissue macrophages of sepsis .

Methods : The expression level of TREM - 2 in liver , lung and spleen was determined by immunohistochemistry . The levels of TREM - 2 in liver , lung and spleen were detected by immunohistochemistry . The levels of TREM - 2 in liver , lung and spleen were detected by immunohistochemistry . The concentration of TREM - 2 was detected by enzyme linked immunosorbent assay ( ELISA ) . The levels of IL - 4 , IL - 13 and IL - 10 in peripheral blood were detected by enzyme linked immunosorbent assay ( ELISA ) .

Results : The expression of TREM - 2 in septic mice was similar to that of TREM - 2 at 72 h after CLP . However , the change of TREM - 2 expression was similar to that of TREM - 2 at 72 h after operation .

The effect of TREM - 2 on the pathogenesis of sepsis

Objective : To investigate the effect and mechanism of blocking endogenous TREM - 2 on sepsis . Methods : After 24 hours , 72 h and 120 h after the administration of recombinant protein , 20 渭g mouse TREM - 2 / human IgG1 recombinant protein ( mTREM - 2 / IgG1 group ) and 20渭g human IgG1 recombinant protein ( IgG1 group ) were randomly divided into two groups .

Results : The 7 - day survival rate of mTREM - 2 / IgG1 group was significantly lower than that of IgG1 group ( 8.3 % vs . 50 % ) .
P0.05). After 24 h of recombinant protein , there was no significant difference between the two groups ( P0.05 ) .
After 72 h and 120 h of recombinant protein , the mice of mTREM - 2 / IgG1 group were significantly higher than those in IgG1 group ( P0.05 ) . There was no significant difference in the concentrations of IL - 10 in peritoneal lavage fluid and peripheral blood in both groups .

Conclusion : Blocking the effects of TREM - 2 on the 7 - day survival rate of septic mice may be related to the bacterial infection in septic mice .

The effect of TREM - 2 on sepsis was studied by Western - blot and flow cytometry .
The effect of recombinant TREM - 2 on 7 - day survival rate of mice was studied by means of agar plate culture .

Conclusion : The early enhancement of TREM - 2 expression in sepsis has protective effect on sepsis , which can effectively improve the prognosis of sepsis .
The mechanism of action is closely related to its phagocytic function .
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R459.7

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本文編號(hào)：1933927