本文選題：急性肺損傷/急性呼吸窘迫癥 + 肺微血管損傷和修復(fù)��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：急性肺損傷(Acute Lung Injury,ALI)和急性呼吸窘迫綜合癥(Acute Respiratory Distress Syndrome,ARDS)是呼吸系統(tǒng)常見危重癥之一,對人類的健康和生產(chǎn)生活造成了嚴(yán)重的影響。目前,臨床上治療措施有限,死亡率居高不下。因此,探索ALI/ARDS的發(fā)病機(jī)制,尋求治療手段的新途徑,具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。ALI/ARDS的病理生理特征主要是肺內(nèi)的炎癥反應(yīng)以及毛細(xì)血管膜破損導(dǎo)致的肺水腫,在此過程中,肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞最早受到傷害,是ALI/ARDS發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此,促進(jìn)受損的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞再生,對修復(fù)微血管完整性,減輕肺組織炎性滲出,延緩肺損傷進(jìn)一步發(fā)展具有重要意義。而促進(jìn)血管再生修復(fù)的機(jī)制十分復(fù)雜,目前,研究者們?nèi)匀辉诓粩嗵剿髋c肺微血管內(nèi)皮再生能力相關(guān)的調(diào)控因素,籍此找到潛在的治療靶點(diǎn)。細(xì)胞分裂周期蛋白42(cell division cycle 42),簡稱Cdc42,是Rho家族蛋白中的重要成員,分子量大小為25KD。它具有很多非常重要的生物學(xué)活性,例如調(diào)控細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移,維持細(xì)胞極性等等。近年來,研究者們利用Cre/Loxp條件性基因敲除技術(shù)構(gòu)建動物體內(nèi)特定器官或組織上敲除Cdc42基因的模型,來探索Cdc42的調(diào)控作用及機(jī)制。在本課題中,我們利用該技術(shù)構(gòu)建了全身血管內(nèi)皮特異性敲除Cdc42基因的小鼠,首次探索了 Cdc42在急性肺損傷中對肺微血管血管內(nèi)皮損傷與修復(fù)的影響及機(jī)制,旨在發(fā)現(xiàn)能夠促進(jìn)血管修復(fù)、改善ALI損傷程度的有效治療手段。研究方法:1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn):1.1 pull-down實(shí)驗(yàn)檢測急性肺損傷中肺組織的Cdc42活性水平。1.2利用cre/loxp技術(shù)構(gòu)建血管內(nèi)皮特異性敲除Cdc42基因小鼠模型,并在此基礎(chǔ)上再建立急性肺損傷,進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)步驟。1.3所有小鼠收集左肺組織進(jìn)行固定、脫水、包埋,隨后進(jìn)行HE及病理評分,免疫組化染色觀察血管內(nèi)皮增殖作用;右肺收集后提取蛋白,進(jìn)行western blot實(shí)驗(yàn)檢測Cdc42蛋白表達(dá)水平。2.體外實(shí)驗(yàn)2.1培養(yǎng)原代肺微管內(nèi)皮細(xì)胞,利用cre/loxp技術(shù)構(gòu)建敲除Cdc42基因細(xì)胞模型。2.2選用人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞系,利用小RNA干擾技術(shù)敲低Cdc42表達(dá);在構(gòu)建好的細(xì)胞模型中,用BrdU檢測細(xì)胞增殖能力,劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力,細(xì)胞跨膜電阻(TEER)和異硫氰酸熒光素一右旋糖苷透過率(FITC-Dextran)評價細(xì)胞屏障功能,用Matrigel實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞形成血管能力。2.3提取細(xì)胞蛋白,進(jìn)行western blot分析,檢測Cdc42下游相關(guān)信號通路的變化。3.相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。研究結(jié)果:1.ALI中肺組織Cdc42活性水平表達(dá)LPS損傷處理后,肺組織中Cdc42GTP的表達(dá)水平有明顯改變。對比LPS未處理組(正常組),LPS1d組Cdc42GTP表達(dá)有所下降,LPS處理后7天組的Cdc42GTP表達(dá)顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.穩(wěn)定構(gòu)建了血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性敲除Cdc42基因的動物和原代細(xì)胞模型構(gòu)建動物模型后,敲除組的肺組織中Cdc42蛋白表達(dá)明顯小于未敲除組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。原代肺微血管細(xì)胞模型中,腺病毒敲除組的Cdc42蛋白表達(dá)同樣小于對照組。3.穩(wěn)定構(gòu)建了敲低Cdc42水平的HPMVE細(xì)胞系。HPMVEC轉(zhuǎn)染siControl質(zhì)粒及siCdc42質(zhì)粒后,三個siCdc42都能抑制Cdc42蛋白表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.動物水平上,在小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞上Cdc42基因敲除對ALI后炎性細(xì)胞浸潤、微血管滲漏以及肺微血管增殖能力的影響Cdc42敲除組的ALI損傷評分、肺血管周圍中性粒細(xì)胞浸潤程度、肺微血管漏出率都明顯大于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與對照組比較,敲除組血管增殖能力明顯下降。5.敲低HPMVEC中Cdc42水平對細(xì)胞增殖、遷移、成管等的影響與對照組相比,siCdc42組的血管內(nèi)皮增殖、遷移和血管成型能力明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(P0.05)。6.敲低細(xì)胞中Cdc42表達(dá)水平可以下調(diào)PAK1/Akt信號通路的表達(dá)水平。敲低Cdc42后,減少了 PAK1、AKT的磷酸化及總量表達(dá),并下調(diào)了VE-cadherin蛋白表達(dá),對p-JNK/JNK、p-P38/P38等的表達(dá)無影響。研究結(jié)論:1.Cdc42與肺炎性損傷的關(guān)系:Cdc42的缺失加重了 ALI中的炎性細(xì)胞浸潤、肺微血管滲漏,破壞肺微血管屏障功能。因而Cdc42有可能成為改善ALI/ARDS的治療靶點(diǎn)。2.Cdc42與肺微血管再生修復(fù)作用的關(guān)系:體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí),敲除Cdc42基因降低了肺微血管增殖能力;體外實(shí)驗(yàn)證實(shí),下調(diào)Cdc42表達(dá)水平降低了肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、成管等一系列血管再生修復(fù)的能力。因此Cdc42是肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷后再生修復(fù)的重要調(diào)控因子。3.Cdc42調(diào)控ALI中肺微血管細(xì)胞再生修復(fù)的機(jī)制:下調(diào)Cdc42表達(dá)水平降低了 PAK1/AKT信號通路的表達(dá)水平,因此Cdc42可能是通過PAK1/Akt信號通路來發(fā)揮調(diào)控作用。
[Abstract]:Acute lung injury ( ALI ) and acute respiratory distress syndrome ( ARDS ) are one of the most common causes of acute respiratory distress syndrome ( ARDS ) . The expression of Cdc42 protein in lung tissue was significantly higher than that in control group ( P0.05 ) . Cdc42 is an important regulation factor for the regeneration and repair of pulmonary microvascular endothelial cells ( ALI / ARDS ) .

【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R563.8

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本文編號：1886250