本文選題：膿毒癥 + 曲美他嗪�。� 參考：《華中科技大學》2016年博士論文

【摘要】：研究背景與目的膿毒癥是機體對感染產(chǎn)生的全身性炎癥反應,最終導致膿毒癥休克和多器官功能衰竭。據(jù)全美流行病學的調查研究統(tǒng)計,膿毒癥患者中有40%～50%合并心肌功能受損,其中出現(xiàn)嚴重心力衰竭者約占7%。膿毒癥心肌病所導致的心肌損傷是重癥膿毒癥患者死亡的重要原因。有研究發(fā)現(xiàn),膿毒癥引起機體的免疫系統(tǒng)的過度應答,尤其是巨噬細胞產(chǎn)生的大量的炎癥因子和活性氧簇,對心肌細胞產(chǎn)生不可逆轉的損傷。并且有研究指出,心肌細胞的損傷,尤其是心肌收縮功能受限和心肌細胞凋亡,是引起心臟功能不全的重要原因。曲美他嗪(Trimetazidine, TMZ),臨床上常用的治療心絞痛的藥物。曲美他嗪通過抑制心肌β氧化途徑的關鍵酶——長鏈-3-酮酰輔酶A硫解酶,使心肌能量代謝由游離脂肪酸氧化代謝供能為主,轉變?yōu)橛善咸烟茄趸┠転橹?是其緩解心絞痛的藥理作用機制。正常心肌能量代謝60%-70%來自于脂肪酸β氧化,20%-25%來自葡萄糖的氧化代謝,50%-10%來自糖酵解。而脂肪酸p氧化產(chǎn)生等量的ATP耗氧量要比葡萄糖氧化代謝高。在心肌缺血缺氧時,曲美他嗪能夠增加葡萄糖的利用,抑制脂肪酸氧化,進而提高心肌細胞產(chǎn)生能量的效率。近年來,有文獻報道,曲美他嗪通過緩解氧化應激,減輕炎癥來改善左心室重塑。而在膿毒癥心臟病中,曲美他嗪能否發(fā)揮作用尚無文獻報道。因此在本研究中,我們采用脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導的膿毒癥小鼠模型,探討曲美他嗪對膿毒癥心肌損傷是否有保護作用。并在體外利用巨噬細胞和心肌細胞,研究曲美他嗪對內(nèi)毒素誘導的巨噬細胞的細胞因子產(chǎn)生及其介導的心肌細胞損傷的作用及可能的分子機制。實驗方法和結果1.首先,我們采用C57BL/6小鼠,通過腹腔注射LPS建立膿毒癥的動物模型。根據(jù)曲美他嗪(TMZ)處理時間的不同,我們分別采用了兩種模型,第一種為TMZ預處理模型：即在LPS誘導前三天給予TMZ灌胃處理；第二種為TMZ治療模型：即在LPS誘導6小時后給予TMZ灌胃處理。通過心臟超聲和Millar導管血流動力學檢測,評價小鼠的心功能。結果表明,無論是在TMZ預處理模型還是TMZ治療模型中,TMZ均能顯著緩解LPS引起的心臟功能受損,包括提高左心室射血分數(shù)和縮短分數(shù),降低左室內(nèi)徑和左室舒張末期壓,增加左心室壓力上升速率。同時,我們發(fā)現(xiàn)TMZ治療模型中,TMZ明顯緩解LPS引起的低血壓,增加LPS所誘導的膿毒癥心肌病小鼠的存活率。2.對于TMZ預處理模型,LPS注射6小時后,留取心肌組織和血漿。采用心肌TUNEL染色和F4/80免疫組織化學染色檢測心肌細胞的凋亡和心臟巨噬細胞的浸潤。應用real-time RT-PCR和ELISA檢測心肌組織和血漿中的促炎細胞因子的表達。結果表明,在膿毒癥小鼠心臟中,心肌細胞凋亡增加,血漿和心臟中的炎癥因子(TNFa,MCP-1, IL-1β, IL-6)顯著增加,同時伴隨著巨噬細胞在心臟中的聚集增多。而TMZ明顯緩解了心肌細胞的凋亡,降低血漿和心臟組織中炎癥因子的產(chǎn)生,減少巨噬細胞的聚集。3.為了明確TMZ影響巨噬細胞的募集是作用在心臟,還是骨髓,我們進行了骨髓移植實驗。將未處理(WT)或者TMZ預先灌胃的小鼠的骨髓移植到經(jīng)亞致死量放射線照射后的WT或者TMZ組老鼠中,構建了四種骨髓移植嵌合體模型。即(1)將供體小鼠(對照組,WT)的骨髓提取出來,經(jīng)尾靜脈注射入經(jīng)亞致死劑量放射線照射受體小鼠(對照組,WT)體內(nèi)(WTWT組)；(2)將供體小鼠(對照組,WT)的骨髓提取出來,經(jīng)尾靜脈注射入經(jīng)亞致死劑量放射線照射受體小鼠(在骨髓移植前三天,進行TMZ灌胃組)體內(nèi)(WTTMZ組);(3)將供體小鼠(在骨髓移植前三天,進行TMZ灌胃組)的骨髓提取出來,經(jīng)尾靜脈注射入經(jīng)亞致死劑量放射線照射受體小鼠(對照組,WT)體內(nèi)(TMZWT組)：(4)將供體小鼠(在骨髓移植前三天,進行TMZ灌胃組)的骨髓提取出來,經(jīng)尾靜脈注射入經(jīng)亞致死劑量放射線照射受體小鼠(在骨髓移植前三天,進行TMZ灌胃組)體內(nèi)(TMZTMZ組)。再用LPS誘導膿毒癥模型。LPS注射6小時后,通過心臟超聲和Millar導管血流動力學檢測,評價小鼠的心功能。隨后留取心肌組織,采用蘇木素-伊紅觀察心肌結構,同時應用F4/80染色觀察心臟巨噬細胞浸潤,以及流式細胞術觀察心臟中單核細胞核巨噬細胞的聚集情況。結果顯示,接受TMZ預先處理的骨髓移植的小鼠(即TMZWT和TMZTMZ組)表現(xiàn)出較好的心功能,包括降低的左室的內(nèi)徑和左室舒張末期壓,增加的左心室壓力上升速率和左心室收縮末期壓以及較高的左心室射血分數(shù)和縮短分數(shù)值。并目.TMZWT和TMZTMZ組心肌細胞排列整齊,心臟中巨噬細胞聚集顯著緩解,且巨噬細胞的降低程度跟其前體單核細胞降低的程度類似。上述結果提示提示TMZ主要通過作用于骨髓源性細胞,而非心肌細胞和其他實質性臟器細胞,減少了膿毒癥小鼠心肌組織中的巨噬細胞,及其前體單核細胞的浸潤,進而改善了膿毒癥心功能損傷。此外,我們還將F4/80染色的巨噬細胞數(shù)目和心功能指標進行相關性分析。分析結果表明,心功能的改善和心臟中巨噬細胞的數(shù)目呈負相關。即心臟中巨噬細胞數(shù)目越多,心功能越差。4.接下來的研究中我們通過流式分選分別獲得了有TMZ預處理和無TMZ預處理條件下,LPS誘導的小鼠心臟中的巨噬細胞。同時提取了原代腹腔巨噬細胞,采用TMZ、LPS干預。應用real-time RT-PCR檢測了分選的心臟巨噬細胞和干預的原代腹腔巨噬細胞中炎癥因子的表達。結果顯示TMZ能夠明顯的減少膿毒癥小鼠心臟巨噬細胞以及LPS干預的原代腹腔巨噬細胞炎癥因子的表達,表明TMZ在抑制心臟巨噬細胞和腹腔原代巨噬細胞的炎癥因子的產(chǎn)生的效應是一致的。鑒于分選的心臟巨噬細胞數(shù)量極低,因此在接下來的研究中,我們采用了腹腔原代巨噬細胞作為研究對象。5.為了進一步研究巨噬細胞是否跟心肌細胞之間存在交互作用(相互影響),我們將巨噬細胞跟原代心肌細胞利用Transwell小室進行共同培養(yǎng)。Transwell、室上層的巨噬細胞經(jīng)過預先加藥處理(LPS, TMZ, LPS+TMZ和LPS+促炎細胞因子中和抗體)后,再跟下層的心肌細胞培養(yǎng),然后用流式細胞術檢測心肌細胞的凋亡情況。研究結果表明,LPS處理的巨噬細胞能明顯增加心肌細胞凋亡,TMZ預處理的巨噬細胞則能顯著降低LPS誘導的心肌細胞凋亡。而LPS+促炎細胞因子中和抗體組的巨噬細胞誘導心肌細胞凋亡的能力也下降,這一效應與TMZ類似,說明TMZ可能通過降低巨噬細胞中炎癥因子的表達,從而緩解巨噬細胞所介導的心肌細胞凋亡。6.在體外培養(yǎng)的原代腹腔巨噬細胞中,我們采用TMZ、LPS干預,同時加入ROS的清除劑NAC,采用熒光探針DHE檢測巨噬細胞活性氧(reactive oxygen species, ROS)的水平,同時應用real-time RT-PCR檢測巨噬細胞的炎癥因子表達。結果提示TMZ降低LPS誘導的ROS的生成和促炎細胞因子表達,這一效應與加入了ROS的清除劑NAC類似。7.在分子機制方面,首先在TMZ預處理模型留取的心肌組織中,提取蛋白,采用Western blotting檢測細胞核和細胞漿內(nèi)的Sirt1蛋白表達水平。結果提示,LPS明顯抑制Sirt1由胞漿進入胞核,TMZ顯著增加Sirt1從胞漿進入胞核。在體外,以原代腹腔巨噬細胞作為研究對象,采用TMZ、LPS和Sirt1抑制劑NAM或轉染Sirt1的si-RNA干預后,通過Western blotting檢測細胞核和細胞漿內(nèi)的Sirt1以及NADPH亞基gp91phox和p47phox的蛋白表達水平,熒光探針DHE檢測巨噬細胞內(nèi)ROS的水平,以及real-time RT-PCR檢測巨噬細胞的炎癥因子表達水平。結果表明,LPS明顯增加巨噬細胞ROS的生成和促炎細胞因子的表達以及gp91phox和p47phox的蛋白表達,抑制Sirt1由胞漿進入胞核。而TMZ顯著的抑制LPS誘導的ROS的生成和促炎細胞因子的表達以及gp91phox和p47phox的蛋白表達,并且增加Sirt1從胞漿進入胞核。然而TMZ的抑制LPS誘導巨噬細胞ROS介導的炎癥應答的這一效應,能被Sirt1抑制劑NAM阻斷,說明TMZ通過Sirt1在巨噬細胞中發(fā)揮抗氧化應激作用,并降低炎癥因子的釋放。8.進一步,在體外培養(yǎng)的原代腹腔巨噬細胞中,采用TMZ、LPS和Sirt1抑制劑NAM干預后,收集蛋白,通過Western blotting檢測p-AMPK和AMPK的蛋白表達水平。結果表明LPS顯著抑制AMPK的磷酸化水平,TMZ顯著增加LPS抑制的AMPK的磷酸化水平。而加入Sirt1的抑制劑NAM或者轉染Sirt1的si-RNA后,TMZ增加AMPK的磷酸化水平被抑制。說明TMZ能夠通過Sirt1影響AMPK的磷酸化水平。同時,我們還采用了AMPK抑制劑Compound C干預。干預后收集蛋白,通過Western blotting檢測Nrf2和HO-1的蛋白表達水平。并采用熒光探針DHE檢測ROS的水平,以及real-time RT-PCR檢測炎癥因子的表達。結果提示TMZ顯著增加LPS抑制的Nrf2和HO-1的表達水平,降低LPS誘導的ROS的生成和促炎細胞因子的表達。而AMPK的抑制劑Compound C逆轉了TMZ增加Nrf2和HO-1的表達的作用,抑制了TMZ的抗氧化應激和緩解炎癥因子釋放的作用。以上結果提示,TMZ通過Sirt1/AMPK,增加Nrf2和HO-1的表達水平,減少ROS的生成,最終緩解巨噬細胞的促炎應答。9.另一方面,在體外培養(yǎng)的原代腹腔巨噬細胞中,采用TMZ、LPS和Sirt1抑制劑NAM干預后,收集蛋白,用Western blotting檢測核PPARa的表達。結果表明LPS顯著降低核PPARa的表達水平。與LPS組相比,TMZ顯著增加巨噬細胞的核PPARa的表達。而Sirtl抑制劑NAM部分阻斷了TMZ增加LPS誘導的巨噬細胞的核PPARa的表達的作用,提示TMZ能夠通過Sirtl影響核PPARa的表達。進一步,采用TMZ、 LPS和PPARa拮抗劑GW6471干預原代腹腔巨噬細胞后,收集蛋白,用Western blotting檢測IκBa磷酸化和核p65的表達水平,同時,采用熒光探針DHE檢測ROS的水平,以及real-time RT-PCR檢測炎癥因子的表達。結果提示TMZ能顯著降低LPS導致的p-lκBa/IκBα和NF-κBp65的表達增加,降低LPS誘導的ROS的生成和促炎細胞因子的表達。PPARa拮抗劑GW6471部分阻斷了TMZ降低p-IκBα/IκBa和NF-κB p65表達的作用,抑制了TMZ的抗氧化應激和緩解炎癥因子釋放的作用。以上結果提示TMZ通過Sirt1/PPARa,減弱p-IκBα和核p65的表達,減少ROS的生成,最終緩解巨噬細胞的促炎應答。10.最后,我們收集了經(jīng)LPS,LPS+TMZ, LPS+TMZ+抑制劑(Sirtl抑制劑NAM,AMPK抑制劑Compound C和PPARa拮抗劑GW6471)處理過的巨噬細胞條件培養(yǎng)基,干預心肌細胞,并用ELISA對巨噬細胞條件培養(yǎng)基中的炎癥因子的檢測。同時用流式細胞術,檢測條件培養(yǎng)基處理的心肌細胞的凋亡水平。ELISA結果提示TMZ降低LPS導致的促炎細胞因子的釋放,而Sirtl, AMPK和PPARa的抑制劑逆轉了TMZ降低促炎細胞因子釋放的作用。流式細胞術結果顯示LPS處理的條件培養(yǎng)基可以顯著增加心肌細胞的凋亡,LPS+TMZ處理的條件培養(yǎng)基則細胞凋亡明顯降低,而TMZ的效應可以被Sirtl抑制劑NAM,AMPK抑制劑Compound C和PPARa拮抗劑GW6471所阻斷。以上結果表明,TMZ通過影響Sirt1/AMPK和Sirt1/PPARa這些分子進而影響炎癥因子的表達,最終緩解巨噬細胞所介導的心肌細胞凋亡作用。結論曲美他嗪能夠改善內(nèi)毒素誘導的膿毒癥心肌損傷。緩解膿毒癥心肌損傷的機制主要是通過減輕心臟中巨噬細胞的浸潤和巨噬細胞炎癥應答所介導的心肌細胞凋亡,這為膿毒癥心肌功能障礙提供一個新的預防和治療策略。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R459.7;R542.2

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 ;豚鼠巨噬細胞經(jīng)P_(204)處理后的抗石英細胞毒作用[J];國外醫(yī)學參考資料(衛(wèi)生學分冊);1976年04期

2 鄧俠進;;巨噬細胞的抗癌作用[J];遵義醫(yī)學院學報;1979年02期

3 陸天才;;疾病對肺巨噬細胞的影響[J];煤礦醫(yī)學;1982年01期

4 郭瑞清;祝彼得;;一種分離巨噬細胞的簡單方法[J];濱州醫(yī)學院學報;1990年02期

5 謝志堅;巨噬細胞異質性[J];醫(yī)學綜述;2001年06期

6 饒艷;運動及神經(jīng)內(nèi)分泌對巨噬細胞功能的調節(jié)[J];體育與科學;2002年05期

7 朱金元;;吸煙對肺巨噬細胞的影響[J];浙江醫(yī)學教育;2003年01期

8 張俊峰;過氧化物酶體增殖物激活受體與單核/巨噬細胞系[J];醫(yī)學綜述;2004年03期

9 韋錦學;顧軍;;巨噬細胞的激活誘導死亡[J];生命科學;2006年02期

10 李曉曦;郭寧;曹雪濤;;腫瘤相關巨噬細胞促進腫瘤生長與轉移的研究現(xiàn)狀[J];中國腫瘤生物治療雜志;2008年01期

相關會議論文 前10條

1 史玉玲;王又明;豐美福;;巨噬細胞激活作用的研究[A];中國細胞生物學學會第五次會議論文摘要匯編[C];1992年

2 吳國明;周輝;;巨噬細胞和創(chuàng)傷纖維化[A];2009年浙江省骨科學學術年會論文匯編[C];2009年

3 李奇;王海杰;;透明質酸對于淋巴結巨噬細胞運動的影響[A];解剖學雜志——中國解剖學會2002年年會文摘匯編[C];2002年

4 劉革修;歐大明;劉軍花;黃紅林;廖端芳;;丙丁酚在體外能抑制巨噬細胞脂質氧化介導的低密度脂蛋白氧化并調節(jié)氧化巨噬細胞的分泌功能[A];面向21世紀的科技進步與社會經(jīng)濟發(fā)展（下冊）[C];1999年

5 葉金善;楊麗霞;郭瑞威;;環(huán)氧化酶-2/前列腺素E_2在血管緊張素Ⅱ刺激巨噬細胞表達細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子中的作用[A];第十三次全國心血管病學術會議論文集[C];2011年

6 秦帥;陳希;孔德明;;構建由綠色熒光標記巨噬細胞的轉基因斑馬魚系[A];貴州省中西醫(yī)結合內(nèi)分泌代謝學術會論文匯編[C];2012年

7 武劍華;徐惠綿;;腫瘤相關巨噬細胞在胃癌中的相關研究[A];第9屆全國胃癌學術會議暨第二屆陽光長城腫瘤學術會議論文匯編[C];2014年

8 何軍;;血凝素樣氧化型低密度脂蛋白受體升高巨噬細胞內(nèi)膽固醇水平[A];中華醫(yī)學會第11次心血管病學術會議論文摘要集[C];2009年

9 宋盛;周非凡;邢達;;PDT誘導的凋亡細胞對巨噬細胞NO合成的影響[A];第七屆全國光生物學學術會議論文摘要集[C];2010年

10 張磊;朱建華;黃元偉;姚航平;;血管緊張素Ⅱ對巨噬細胞(THP-1重細胞)凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體表達的影響[A];浙江省免疫學會第五次學術研討會論文匯編[C];2004年

相關重要報紙文章 前10條

1 通訊員 李靜 記者 胡德榮;惡性腫瘤巨噬細胞未必皆“惡人”[N];健康報;2014年

2 蘭克;以嘗試用巨噬細胞治癱瘓[N];科技日報;2000年

3 薛佳;免疫系統(tǒng)——人體的“衛(wèi)士”[N];保健時報;2009年

4 記者 胡德榮;鐵泵蛋白“維穩(wěn)”鐵代謝作用首次闡明[N];健康報;2011年

5 侯嘉 何新鄉(xiāng);硒的神奇功能[N];中國食品質量報;2003年

6 唐穎 倪兵 陳代杰;巨噬細胞泡沫化抑制劑研究快步進行[N];中國醫(yī)藥報;2006年

7 劉元江;新發(fā)現(xiàn)解釋腫瘤為何易成“漏網(wǎng)之魚”[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2007年

8 本報記者 侯嘉 通訊員 何新鄉(xiāng);今天你補硒了嗎[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2003年

9 左志剛;升血小板藥使用注意[N];醫(yī)藥養(yǎng)生保健報;2007年

10 記者 許琦敏;“鐵泵”蛋白幫助回收鐵元素[N];文匯報;2011年

相關博士學位論文 前10條

1 周赤燕;巨噬細胞MsrA對動脈粥樣硬化的干預研究[D];武漢大學;2013年

2 章桂忠;TIPE2蛋白調控細胞增殖和炎癥的機制研究[D];山東大學;2015年

3 張瑜;DKK1抑制巨噬細胞內(nèi)脂質沉積及其相關分子機制[D];山東大學;2015年

4 孟濤;異丙酚對心臟收縮功能的抑制作用及其對巨噬細胞分泌功能調節(jié)的機制研究[D];山東大學;2015年

5 周興;基于酵母微囊構建新型口服巨噬細胞靶向遞送系統(tǒng)的研究[D];第三軍醫(yī)大學;2015年

6 蔣興偉;Tim-3對巨噬細胞極化的調控機制研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2015年

7 劉伯玉;清道夫受體A介導小鼠巨噬細胞吞噬鉤端螺旋體研究[D];上海交通大學;2013年

8 楊紹俊;miRNA-155介導ESAT-6誘導巨噬細胞凋亡的分子機制及其在結核診斷中的作用[D];第三軍醫(yī)大學;2015年

9 翟光耀;單核/巨噬細胞Ly6C~(low)亞群在心肌梗死后瘢痕形成期的抗炎特性研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2014年

10 韓露;TRB3介導的脂肪組織巨噬細胞極化與糖尿病冠狀動脈病變關系的研究[D];山東大學;2015年

相關碩士學位論文 前10條

1 馬春梅;AP0E~(-/-)小鼠TLR9介導巨噬細胞極化效應對動脈粥樣硬化作用的研究[D];福建醫(yī)科大學;2015年

2 張譯丹;鹽皮質激素受體拮抗劑調控巨噬細胞表型對實驗性矽肺的作用[D];河北醫(yī)科大學;2015年

3 盧文冉;HCV core蛋白作用的巨噬細胞培養(yǎng)上清對肝細胞生物學性狀的影響[D];河北醫(yī)科大學;2015年

4 李文建;載脂蛋白E影響巨噬細胞因子表達及分型的機制研究[D];河北醫(yī)科大學;2015年

5 曹爽;高糖對巨噬細胞TLR4信號轉導的調節(jié)作用[D];河北醫(yī)科大學;2015年

6 寧程程;腫瘤相關巨噬細胞在子宮內(nèi)膜癌雌激素敏感性中的作用及機制研究[D];復旦大學;2014年

7 高龍;PLD4在腫瘤相關巨噬細胞抑制結腸癌增殖中的作用研究[D];成都醫(yī)學院;2015年

8 任虹;感染期子宮頸癌U14細胞荷瘤小鼠抑制巨噬細胞CCL5分泌的機制研究[D];河北醫(yī)科大學;2015年

9 李美玲;雙酚A對小鼠腹腔巨噬細胞極化影響的體外研究[D];安徽醫(yī)科大學;2015年

10 劉瓊;黃芪多糖影響巨噬細胞向脂肪細胞趨化的作用及機制研究[D];新鄉(xiāng)醫(yī)學院;2015年

，

本文編號：1838965