發(fā)布時間：2018-04-22 16:17

  本文選題：脂肪來源的間充質(zhì)干細胞 + 馴化的巨噬細胞��； 參考：《浙江大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：第一部分 間充質(zhì)干細胞馴化的巨噬細胞在膿毒癥肺損傷中的作用研究目的：脂肪來源間充質(zhì)干細胞(Adipose mesenchymal stem cells, ASC)是一種多能分化干細胞,除了再生分化,也參與機體的免疫調(diào)節(jié)。近年來研究發(fā)現(xiàn)ASCs對LPS誘導(dǎo)的肺損傷具有保護作用,而ASCs馴化的巨噬細胞直接輸注對肺損傷的作用未見報道。本部分研究主要通過小鼠模型在體觀察脂肪來源的間充質(zhì)干細胞(adipose-mesenchymal stem cells, ASCs)馴化的巨噬細胞在LPS誘導(dǎo)的肺損傷發(fā)生發(fā)展中的作用。研究方法：采用LPS (Lipopolysaccharide,脂多糖)誘導(dǎo)WT (C57BL/6)小鼠致肺損傷模型,造模后觀察小鼠6h、24h、48h體重增長情況；HE染色觀察肺臟形態(tài)學(xué)改變；肺組織稱重濕干比檢測肺水腫；Luminex檢測血液及支氣管肺泡灌洗液炎癥因子TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-13水平。研究結(jié)果：模型后6h和48h ASC組及EM組小鼠體重增長、HE染色中性粒細胞計數(shù)及肺濕干比與LPS組相比均無顯著差異,而模型后24 h, ASC組與EM組的體重增長較LPS組顯著增加(*P0.05,*P0.05)；中性粒細胞計數(shù)的增加亦明顯少于LPS組(*P0.01, *P0.05); LPS組的肺濕干比增加最大,48h恢復(fù),而ASC組及EM組的肺濕干比增加不明顯、幾乎沒有肺水腫情況發(fā)生(*P0.05,*P0.05)。模型后24 h及48 h, ASC組及EM組小鼠外周血與支氣管肺泡灌洗液中細胞因子均較LPS組小鼠無差異表現(xiàn),而在模型6h時,ASC組及EM組小鼠外周血與支氣管肺泡灌洗液中細胞因子均較LPS組小鼠有改善,血清中IFN-7 (*P0.001, *P0.001)和IL-6 (*P0.01, *P0.001)升高水平降低而IL-10 (*P0.001, *P0.01)增加,同時減輕肺泡灌洗液中IL-6的水平(*P0.001,*P0.001),而IL-4 (*P0.01, *P0.001), IL-10 (*P0.001, *P0.001)和IL-13 (*P0.001, *P0.001)的水平反而增高。研究結(jié)論：ASCs馴化的巨噬細胞與ASCs-樣,對LPS所致急性肺損傷有保護作用。第二部分 間充質(zhì)干細胞馴化的巨噬細胞在膿毒癥肺損傷中的分子機制的研究研究目的：通過第一部分研究發(fā)現(xiàn),ASCs可以體外馴化巨噬細胞,馴化的巨噬細胞與ASCs-樣可以提高肺臟免疫防御能力,減少致炎性炎癥因子的瀑布鏈反應(yīng),增加抑炎型炎癥因子的表達,減輕肺損傷,對膿毒癥肺損傷同樣具有保護作用。本部分通過模擬離體膿毒癥肺損傷的微環(huán)境,探討ASCs馴化巨噬細胞對肺損傷保護的的分子機制。研究方法：肉湯刺激C57BL/68周野生鼠獲取腹腔巨噬細胞與ASC共培養(yǎng),Luminex檢測LPS刺激下不同組間炎癥因子變化與流式細胞學(xué)檢測M2細胞含量,人ARDS血清替代體外LPS作用做LPS的體外模擬比對試驗,比較ASC體外在ARDS血清作用下對巨噬細胞表型的作用,給予IL-10刺激巨噬細胞或給予IL-10抗體、IL-10受體的抗體刺激western檢測巨噬細胞內(nèi)Arg蛋白含量及Luminex檢測上清液中各炎癥因子的變化。研究結(jié)果：ASCs與巨噬細胞共培養(yǎng)后M2細胞增加(*P0.05),而Transwell與直接接觸共培養(yǎng)后M2表型無顯著差異(P0.05);ASC直接接觸或transwell共培養(yǎng)后增加了IL-10的表達(*P0.01,*P0.05)而同時降低了IL-6(*P0.001,*P0.001)和TNF-α(*P0.01,*P0.05)的表達。體外人ARDS血清加入巨噬細胞的培養(yǎng)基中后,M2表型減少(*P0.05),而不管直接接觸還是transwell共培養(yǎng),ASC均增加了M2細胞的表達(*P0.01,*P0.05)。IL-10加入LPS刺激的巨噬細胞培養(yǎng)基后前炎癥因子IL-6和TNF-α明顯下降,同時M2給予IL-10抗體后巨噬細胞的Arg蛋白明顯減少,IL-6 (*P0.001,*P0.001)和TNF-α (*P0.01,*P0.001)含量明顯回升。相較于ASC與巨噬細胞共培養(yǎng)組,Western結(jié)果顯示培養(yǎng)基中加入IL-10抗體、IL-10受體的抗體后巨噬細胞內(nèi)的Arg蛋白表達明顯減少,而培養(yǎng)基上清液中炎癥因子IL-6 (*P0.001,*P0.001)、TNF-α的含量繼又增加((*P0.01,*P0.05)。研究結(jié)論：LPS體外刺激可以模擬體內(nèi)ARDS血清作用建立sepsis微環(huán)境,ASCs馴化巨噬細胞不需要直接細胞接觸,馴化的巨噬細胞起作用是通過IL-10途徑進行。第三部分 間充質(zhì)干細胞對膿毒癥患兒外周血炎性單核細胞的影響研究目的：結(jié)合第一部分和第二部分的研究,動物實驗及體外研究均表明ASCs可以馴化巨噬細胞起到抑炎作用。既往研究表明膿毒癥發(fā)生時炎癥瀑布鏈迅速發(fā)生,固有免疫的單核巨噬細胞參與炎癥反應(yīng),ASC通過自身或分泌可溶性因子對機體的組織器官、細胞進行馴化,調(diào)控炎癥免疫狀態(tài)。因此,本部分研究擬采取膿毒癥患兒與對照非膿毒癥患兒的外周血進行流式單核細胞的分型測定,體外給與ASC共培養(yǎng)觀察其在炎癥免疫過程中的作用,從而探討ASC在臨床中的應(yīng)用價值。研究方法：嚴格按照膿毒癥診斷標(biāo)準,收集2015年6月-2015年10月期間在大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院需要急癥手術(shù)的外科膿毒癥患者18例,并將同期10例非膿毒癥外科手術(shù)患兒作為對照組。所有納入患者均在確診膿毒癥后24小時內(nèi)抽取外周血標(biāo)本5m1,分離外周血單核細胞,單獨體外培養(yǎng)或加ASC共培養(yǎng)12h后用BD流式細胞儀檢測炎性單核細胞的比例。所有患者在入院24小時內(nèi)進行PRIM Ⅲ (Pediaticr Risk of Mortality Ⅲ Score)評分及PELOD Ⅱ (Scoring Pediatric Logistic Organ Dysfunction)評分,并作為反應(yīng)膿毒癥預(yù)后指標(biāo)。分別檢測兒童膿毒癥患者與其對照組外周血中炎性單核細胞的比例和與ASC共培養(yǎng)后的膿毒癥患兒外周血中炎性單核細胞的比例。分析炎性單核細胞與臨床預(yù)后評分之間的相關(guān)性。研究結(jié)果：流式細胞檢測證實膿毒癥患者外周血中炎性單核細胞數(shù)量較對照組顯著增加(*P0.05)；這種增多與臨床預(yù)后PRIM Ⅲ評分與PELOD Ⅱ評分相關(guān)(*P0.05)；而體外給與ASC共培養(yǎng)后膿毒癥患者的這種炎性細胞數(shù)量立即減少(*P0.05)。研究結(jié)論：兒童膿毒癥時外周血炎性單核細胞的增多,這種增多與臨床預(yù)后相關(guān),同時ASC在體外與單核細胞共培養(yǎng)時能逆轉(zhuǎn)單核細胞的這種炎性改變。
[Abstract]:The purpose of this study was to investigate the role of bone marrow mesenchymal stem cells ( ASCs ) in the development of lung injury induced by LPS .
HE staining was used to observe the morphological changes of lungs ;
Lung tissue weighed wet - dry ratio was used to detect pulmonary edema ;
The levels of TNF - 偽 , IL - 6 , IFN - 緯 , IL - 4 , IL - 10 and IL - 13 in the blood and bronchial alveolar lavage fluid were detected by Luminex . Results : Compared with LPS group , the body weight of ASC and EM group increased significantly at 6 h and 48 h after the model , while the body weight in ASC group and EM group increased significantly compared with LPS group ( * P0.05 , * P0.05 ) .
The increase of neutrophil count was also significantly lower than that in LPS group ( * P0.01 , * P0.05 ) ; the lung wet - dry ratio of LPS group increased up to 48 hours , while the lung wet - dry ratio in ASC group and EM group was not obvious , almost no case of pulmonary edema occurred ( * P0.05 , * P0.05 ) . The levels of IL - 6 ( * P0.001 , * P0.001 ) , IL - 10 ( * P . 001 , * P0.001 ) , IL - 10 ( * P . 001 , * P0.001 ) and IL - 13 ( * P . 001 , * P0.001 ) increased . In vitro , the expression of IL - 10 ( * P . 01 , * P 0 . 05 ) was increase and the expression of IL - 6 ( * P . 001 , * P . 001 ) and TNF - 偽 ( * P0.01 , * P0.05 ) were increased . The levels of IL - 6 ( * P0.001 , * P0.001 ) and TNF - 偽 ( * P0.01 , * P0.001 ) increased significantly after the addition of IL - 10 antibody and IL - 10 antibody . The expression of IL - 6 ( * P0.001 , * P0.001 ) and TNF - 偽 in the supernatant of culture medium increased significantly ( * P0.01 , * P0.05 ) . Objective : To study the effect of ASCs on peripheral blood inflammatory monocytes in children with sepsis . The results showed that the number of inflammatory monocytes in peripheral blood of children with sepsis was significantly increased compared with control group ( * P0.05 ) .
This increase correlated with the clinical outcome of PRIM 鈪，

本文編號：1787970