發(fā)布時間：2018-04-22 06:18

  本文選題：Tob1 + 腱骨愈合��； 參考：《第二軍醫(yī)大學》2016年博士論文

【摘要】：背景:肌腱-骨交界處損傷修復后形成的瘢痕組織界面,容易發(fā)生再次斷裂,94%肩袖肌腱修復后沒有恢復到腱骨愈合。移植的肌腱和骨之間的瘢痕組織是機械性能弱于本體組織,失敗率高。因此,迫切需要新的修復策略來改善肩袖腱骨愈合。最近,以骨髓間充質干細胞MSCs為基礎的生物治療提供了一種潛在的方法來改善肩袖修復。Tob1是Tob/B細胞易位基因(BTG)家族的一個成員,Tob1能夠通過負性調節(jié)BMP/Smad信號通路調控成骨細胞的增殖和分化。本研究中,我們探討骨髓間充質干細胞Tob1缺失對大鼠肩袖損傷修復模型改善腱骨愈合的影響,Tob1的上游調控目前沒有報道,mi R-218是MSCs中有力的成骨mi R,我們進一步研究其可否調節(jié)Tob1表達和對腱骨愈合的影響。目的:1.探討大鼠骨髓間充質干細胞MSCs的Tob1基因缺失的生物學特性,為下一步研究腱骨愈合打下基礎。2.探討Tob1基因缺失的大鼠MSCs促進肩袖損傷腱骨愈合影響的研究。3.探討調控Tob1表達的mi RNA的鑒定。4.初步觀察mi R-218促進腱骨愈合的體內研究,為將來實現(xiàn)臨床應用提供依據。方法:1.利用全骨髓貼壁的方法分離培養(yǎng)骨髓間充質干細胞MSCs,重組慢病毒編碼Tob1短發(fā)夾RNA(sh RNA)轉染大鼠骨髓間充質干細胞,獲得Tob1基因缺失的MSCs穩(wěn)轉株(MSCs-sh Tob1),Real time RT-PCR和Western blot檢測Tob1基因敲除效果,MTT法檢測MSCs-sh Tob1細胞增殖能力,茜素紅染色檢測MSCs-sh Tob1成骨分化能力,油紅O染色檢測MSCs-sh Tob1成脂分化能力,流式細胞技術檢測MSCs-sh Tob1細胞表面標志物。2.建立大鼠肩袖損傷重建模型,分為對照組、MSCs組和MSCs-sh Tob1組,分別混合生物蛋白膠注入重建的腱骨界面,術后4周、8周取材,通過測定最大載荷和剛度完成生物力學試驗,通過固定后脫鈣、石蠟包埋、切片、HE染色,完成組織學分析,通過實時定量q RT-PCR檢測測定I和II型膠原蛋白的基因表達,從三個方面評價了骨髓間充質干細胞Tob1缺失對大鼠肩袖損傷修復模型腱骨愈合的影響。3.通過生物信息學實驗以及對相關基因的檢測,驗證候選mi RNA是否對目的靶基因的表達產生影響。mi R-218 mimic和mi R-218 inhibitor轉染骨髓間充質干細胞,轉染48小時后,收獲細胞進行進一步的分析。通過QRT-PCR檢測mi R-218對Tob1m RNA表達水平檢測,以確定mi R-218對Tob1 m RNA的影響,Western Blot檢測mi R-218對Tob1蛋白表達水平,以確定mi R-218對Tob1蛋白表達的影響。4.mi R-218慢病毒載體的構建、包裝,轉染骨髓間充質干細胞,q RT-PCR檢測mi R-218的表達水平,Western blot檢測mi R-218對Tob1蛋白表達的影響,建立大鼠肩袖損傷重建模型,分為對照組、MSCs組和MSCs+mi R-218組,分別混合生物蛋白膠注入重建的腱骨界面,術后8周取材,通過測定最大載荷和剛度完成生物力學試驗,通過固定后脫鈣、石蠟包埋、切片、HE染色,完成組織學分析,從兩個方面評價了mi R-218對大鼠肩袖損傷修復模型腱骨愈合的影響。結果:1.重組慢病毒編碼Tob1短發(fā)夾RNA(sh RNA)轉染大鼠骨髓間充質干細胞,通過RT-PCR檢測,發(fā)現(xiàn)感染MSCs后能有效下調內源性Tob1的表達,Western blot檢測發(fā)現(xiàn)Tob1-sh RNA組有效地降低了Tob1在骨髓間充質干細胞的表達。MTT法檢測細胞活性發(fā)現(xiàn)沉默Tob1顯著增加MSCs的增殖活性。茜素紅染色和油紅O染色發(fā)現(xiàn)MSCs-sh Tob1仍有成骨、成脂等多向分化潛能,流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)高表達間充質干細胞表面標志物CD29和CD44,不表達造血干細胞標志物CD34和CD45。表明MSCs-sh Tob1沒有改變間充質干細胞的細胞表型。2.SD大鼠行岡上肌腱切斷和修復。術后4周的MSCs-sh Tob1組最大載荷明顯高于對照組和MSCs組(P0.05),然而三組間的剛度沒有統(tǒng)計學差異(P0.05)。在8周,MSCs-sh Tob1組最大載荷仍最高(P0.05),并且剛度明顯高于對照組和MSCs組(P0.05)。HE染色,術后4周,對照組顯示腱骨界面主要由成纖維細胞骨之間的松散纖維,無軟骨或膠原纖維。在MSCs組和MSCs-sh Tob1組,腱骨交界處界面可見少量的軟骨樣細胞。然而三組之間沒有顯著的差異。術后8周時,對照組膠原纖維稀疏、雜亂的。MSCs組與對照組比,有更多的垂直的膠原纖維相似Sharpey纖維,少量的軟骨細胞。MSCs-sh Tob1組發(fā)現(xiàn)更多的軟骨細胞和纖維軟骨。軟骨細胞規(guī)整、成串排列。通過實時聚合酶鏈反應檢測損傷的肌腱骨連接處Ⅰ、Ⅱ型膠原基因的表達。第4周:MSCs-sh Tob1組中的I型膠原蛋白表達量較對照組和MSCs組有明顯提高;而II型膠原蛋白沒明顯變化。第8周:MSCs-sh Tob1組中的I型膠原蛋白和II型膠原蛋白都有顯著提高(P0.05)。3.通過在線數據庫Target Scan 6.2與mi Randa分析,發(fā)現(xiàn)Tob1 3′UTR(170 177 bp處)上含有一個保守的mi R-218結合位點,我們克隆了Tob13′UTR序列的熒光素酶基因下游,獲得3′Tob1 UTR。熒光素酶報告基因檢測結果顯示mi R-218轉染后的3′Tob1UTR,相對熒光素酶活性明顯降低。mi R-218 mimic和mi R-218 inhibitor對Tob1 m RNA無明顯影響,mi R-218mimic導致Tob1蛋白明顯下調,而mi R-218 inhibitor抑制劑上調Tob1蛋白表達。這些結果提示Tob1是mi R-218的直接目標。4.mi R-218慢病毒感染MSCs細胞,實時PCR證實高度上調表達mi R-218,而Tob1蛋白水平明顯下調。SD大鼠行岡上肌腱切斷和修復。術后8周,MSCs+mi R-218組較對照組和MSCs組最大載荷及剛度均有明顯提高(P0.05),與對照組及MSCs組比較有更多排列更規(guī)整的膠原纖維和軟骨細胞出現(xiàn)(P0.05)�？梢奙SCs+mi R-218有更好的促腱骨愈合作用。結論:本研究顯示骨髓間充質干細胞Tob1缺失有效改善了大鼠肩袖損傷修復模型的腱骨愈合,首次發(fā)現(xiàn)了Tob1的上游調控因子mi R-218,并證明Tob1的表達可被mi R-218調控。過表達mi R-218有效促進大鼠模型的腱骨愈合,類似于Tob1缺失的影響。這些發(fā)現(xiàn)為骨髓間充質干細胞在提高腱骨愈合中的應用提供了理論依據。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect of bone marrow mesenchymal stem cells ( MSCs ) on bone healing . The effects of mi R - 218 and mi R - 218 inhibitor on the expression of Tob1 protein were determined . The results showed that MSCs - sh Tob1 had no effect on the expression of Tob1 protein . Western blot analysis showed that MSCs - sh Tob1 could effectively downregulate the expression of Tob1 protein . Western blot showed that MSCs - sh Tob1 could effectively reduce the expression of Tob1 protein . MSCs-sh Tob1緇勬渶澶ц澆鑽蜂粛鏈，

本文編號：1785973