本文選題：抗蛇毒血清 + 尖吻蝮蛇��； 參考：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：一、研究背景 抗蛇毒血清是世界衛(wèi)生組織推薦的治療毒蛇咬傷的唯一特效藥物。從世界范圍內(nèi)看，目前抗蛇毒血清仍然是通過(guò)免疫馬或羊等動(dòng)物來(lái)獲得。然而，蛇毒是一種復(fù)雜的蛋白質(zhì)、多肽混合物，其中部分具有很強(qiáng)抗原性的毒素，卻沒(méi)有或只有很弱的免疫原性；部分具有很強(qiáng)免疫原性的毒素，卻沒(méi)有或只有很弱的抗原性。毒素抗原性和免疫原性的分離，使得目前使用全蛇毒免疫制備的抗蛇毒血清中還存在沒(méi)有保護(hù)性效價(jià)的免疫球蛋白，進(jìn)一步加重了異源動(dòng)物蛋白造成了過(guò)敏性休克、血清病等嚴(yán)重不良反應(yīng)的發(fā)生。 理想的免疫原應(yīng)該是僅僅包含能夠刺激動(dòng)物產(chǎn)生有效保護(hù)性抗體的致病毒素。 尖吻蝮蛇是一種廣泛分布于我國(guó)南方地區(qū)的蝰科類(lèi)毒蛇。其毒性強(qiáng)，毒液量大，受傷患者病情進(jìn)展快、并發(fā)癥多、預(yù)后差，往往面臨截肢或死亡的威脅，是臨床治療中的一大難題。蛇毒金屬蛋白酶（snake venom metalloproteinases SVMPs）目前被認(rèn)為是尖吻蝮蛇等蝰科類(lèi)毒蛇毒液中含量最豐富、出血活性最強(qiáng)的致病毒素。AaHⅣ是來(lái)源于尖吻蝮蛇毒的出血性P-Ⅲ型SVMPs，具有完整的金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域（催化結(jié)構(gòu)域）、類(lèi)去整合素結(jié)構(gòu)域和富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域（非催化結(jié)構(gòu)域），具有明顯的出血活性和抑制血小板聚集活性。 二、目的和方法 為了減少免疫毒素的種類(lèi)、優(yōu)化免疫原結(jié)構(gòu)、減少不良反應(yīng)發(fā)生率，我們：1）使用親和層析和疏水層析等方法，從尖吻蝮蛇粗毒中純化出天然出血性P-Ⅲ型SVMPsAaHⅣ，并將其作為免疫原，同佐劑一起皮下注射免疫小鼠，3輪免疫后通過(guò)間接ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)，確定其是否具有免疫原性；同時(shí)，比較使用AaHⅣ免疫小鼠與全蛇毒免疫小鼠產(chǎn)生的抗血清對(duì)全蛇毒攻毒的小鼠保護(hù)性差異；2）在前部分實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，，采用基因工程技術(shù)分別合成AaHⅣ催化結(jié)構(gòu)域和非催化結(jié)構(gòu)域cDNA，并分別重組在pET28a（+）質(zhì)粒上表，通過(guò)工程菌E.coli BL21（DE3）誘導(dǎo)表達(dá)；表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni2+-NTA親和層析法進(jìn)行純化，并分別使用AaHⅣ、催化結(jié)構(gòu)域片段、非催化結(jié)構(gòu)域片段、PBS免疫小鼠，3輪免疫后通過(guò)間接ELLISA法檢測(cè)其是否具有免疫原型；同時(shí)，比較使用AaHⅣ催化結(jié)構(gòu)域片段、非催化結(jié)構(gòu)域片段免疫小鼠與使用AaHⅣ免疫小鼠產(chǎn)生的抗血清對(duì)AaHⅣ攻毒的小鼠保護(hù)性差異。 三、結(jié)果 1、天然AaHⅣ蛋白純化 經(jīng)過(guò)離子親和層析和疏水層析，以及脫鹽等步驟，成功從江西產(chǎn)尖吻蝮蛇粗毒中純化到出血性P-Ⅲ型SVMPAaHⅣ蛋白，皮下注射昆明小鼠證明其具有出血活性，并通過(guò)BLISS法測(cè)定其LD50為10.07μg/g。 2、AaHⅣ催化結(jié)構(gòu)域和非催化結(jié)構(gòu)域表達(dá)及純化 根據(jù)Genebank中查詢(xún)到的AaHⅣ催化結(jié)構(gòu)域和非催化結(jié)構(gòu)域mRNA序列，進(jìn)行密碼子最優(yōu)化后，通過(guò)基因合成的方法分別獲得AaHⅣ催化結(jié)構(gòu)域和非催化結(jié)構(gòu)域cDNA，并重組在pET28a(+)表達(dá)質(zhì)粒上。經(jīng)CaCl2法轉(zhuǎn)入工程菌BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)分別表達(dá)出AaHⅣ催化結(jié)構(gòu)域片段和非催化結(jié)構(gòu)域片段。AaHⅣ催化結(jié)構(gòu)域片段表達(dá)形式為包涵體，經(jīng)8mol/L尿素溶液溶解，采用His標(biāo)簽純化，脫鹽后得到AaHⅣ催化結(jié)構(gòu)域片段；AaHⅣ非催化結(jié)構(gòu)域片段表達(dá)形式為可溶蛋白，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni2+-NTA親和層析法純化，脫鹽后得到AaHⅣ非催化結(jié)構(gòu)域片段。 3、抗體效價(jià) 分別使用同批次江西產(chǎn)尖吻蝮蛇毒、AaHⅣ蛋白、AaHⅣ催化結(jié)構(gòu)域片段、AaHⅣ非催化結(jié)構(gòu)域片段、PBS，對(duì)昆明小鼠進(jìn)行腹股溝皮下免疫，首輪免疫使用完全弗氏佐劑，后兩輪免疫使用不完全弗氏佐劑。3輪免疫后1周通過(guò)尾靜脈采血，間接ELISA法提示尖吻蝮蛇毒免疫組、AaHⅣ免疫組、AaHⅣ催化結(jié)構(gòu)域片段免疫組、AaHⅣ非催化結(jié)構(gòu)域片段免疫組小鼠均能產(chǎn)生高效價(jià)IgG抗體。 4、出血抑制實(shí)驗(yàn) 小鼠3輪免疫后摘眼球取血，分離血清，將尖吻蝮蛇毒免疫組、AaHⅣ免疫組和PBS免疫組抗血清分別與尖吻蝮蛇毒混合（5μl：1μg），37℃孵育1小時(shí)后注射未免疫小鼠背部皮膚皮下。24小時(shí)后測(cè)量小鼠皮下出血面積（n=6）：AaHIV免疫組為（44.83±19.48）mm2，尖吻蝮蛇毒免疫組為（1.50±3.67）mm2，PBS組為（134.83±21.97）mm2。經(jīng)one way-ANOVA方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，AaHⅣ免疫組和尖吻蝮蛇毒免疫組皮下出血面積之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001），而AaHⅣ免疫組與PBS組之間皮下出血面積也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.001）。 小鼠3輪免疫后摘眼球取血，分離血清，將AaHⅣ免疫組、催化結(jié)構(gòu)域免疫組、非催化結(jié)構(gòu)域免疫組和PBS免疫組抗血清分別與新鮮純化的AaHⅣ混合（5μl：1μg），37℃孵育1小時(shí)后注射未免疫小鼠背部皮膚皮下。24小時(shí)后測(cè)量小鼠皮下出血面積（n=6）：AaHⅣ免疫組為（2.83±4.92）mm2，催化結(jié)構(gòu)域免疫組為（5.67±6.74）mm2，非催化結(jié)構(gòu)域免疫組為（16.50±11.04）mm2，PBS組為（52.50±16.94）mm2。經(jīng)oneway-ANOVA統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，AaHⅣ免疫組、催化結(jié)構(gòu)域免疫組、非催化結(jié)構(gòu)域免疫組均較PBS組顯著減少出血面積（P＜0.001）；AaHⅣ免疫組與催化結(jié)構(gòu)域免疫組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），而與非催化結(jié)構(gòu)域免疫組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）； 5、攻毒實(shí)驗(yàn) 新鮮配置的尖吻蝮蛇毒溶液2LD50劑量采用腹腔注射的方法對(duì)尖吻蝮蛇毒組小鼠、AaHⅣ組小鼠和PBS組小鼠進(jìn)行攻毒。24小時(shí)后AaHⅣ免疫組死亡3只，尖吻蝮蛇毒免疫組死亡1只，PBS組全部死亡（n=10）。Fisher’s Exact test方法統(tǒng)計(jì)分析提示，尖吻蝮蛇毒免疫組和AaHⅣ免疫組小鼠死亡率沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p=0.58）。尖吻蝮蛇毒免疫組和AaHⅣ免疫組小鼠均與PBS組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＜0.01）。 新鮮純化的AaHⅣ蛋白2LD50劑量采用腹腔注射的方法對(duì)AaHⅣ、AaHⅣ催化結(jié)構(gòu)域片段和非催化結(jié)構(gòu)域片段和PBS組小鼠進(jìn)行攻毒。24小時(shí)后AaHⅣ免疫組存活9只，催化結(jié)構(gòu)域片段免疫組存活8只，非催化結(jié)構(gòu)域片段免疫組存活2只，PBS組存活0只（n=10）。AaHⅣ免疫組和催化結(jié)構(gòu)域片段免疫組小鼠死亡率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。催化結(jié)構(gòu)域片段免疫組和非催化結(jié)構(gòu)域片段免疫組之間(p＜0.05)，非催化結(jié)構(gòu)域片段免疫組與AaHⅣ免疫組之間（P＜0.001）均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 四、結(jié)論 ①AaHⅣ具有免疫原性和抗原性，其免疫小鼠產(chǎn)生的抗體能夠具備對(duì)尖吻蝮蛇粗毒的中和活性，可以作為制備抗蛇毒血清的備選免疫原。 ②AaHⅣ催化結(jié)構(gòu)域片段在P-Ⅳ型SVMPs致病機(jī)制中具有重要作用，顯示出明確的免疫原性和抗原性，其抗血清能夠?qū)π∈螽a(chǎn)生與抗AaHⅣ血清一樣的中和保護(hù)性，可以作為進(jìn)一步優(yōu)化免疫原結(jié)構(gòu)的組成部分。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R646

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 張志曉;楊彥;葉鋒平;范泉水;李東江;張希;符云新;鄭穎;;尖吻蝮蛇蛇毒金屬蛋白酶cDNA序列抗原位點(diǎn)分析及免疫保護(hù)效果觀察[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2010年04期

2 吳夢(mèng);葉鋒平;張志曉;崔慶華;胡挺松;張富強(qiáng);邱薇;郭平;范泉水;鄭穎;;尖吻蝮蛇毒金屬蛋白酶多表位抗原肽的原核表達(dá)和免疫原性研究[J];免疫學(xué)雜志;2013年09期

本文編號(hào)：1757911