本文選題：間充質(zhì)干細胞　切入點：煙堿樣乙酰膽堿受體　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2013年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：多器官功能障礙綜合征（Multiple Organ Dysfunction Syndrome，MODS)是外科重癥監(jiān)護病房內(nèi)患者最常見的死亡原因，MODS的嚴(yán)重程度與患者的住院日和死亡率顯著相關(guān)⑴組織細胞的凋亡與壞死以及全身炎癥反應(yīng)綜合癥（sysetmaticinlfammatory response syndrome，SIRS)是MODS的發(fā)病基礎(chǔ)，是MODS治療中最棘手的問題至今尚無有效的治療方法。 間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs)來源于中胚層，具有自我更新和增殖能力，在恰當(dāng)?shù)奈h(huán)境里具有向血管、脂肪、神經(jīng)、軟骨、骨等多個胚層組織細胞分化的潛能[2]。并且間充質(zhì)干細胞具有免疫調(diào)制功能，可以抑制促炎因子的產(chǎn)生，促進抗炎因子的釋放[3]。間充質(zhì)干細胞具有易獲得、低免疫原性、能在宿主體內(nèi)長期存活并在適宜的微環(huán)境誘導(dǎo)下歸巢到損傷部位且分化為特異的組織細胞，參與自身修復(fù)及免疫調(diào)節(jié)功能等特點w。 煙堿樣乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptors, nAChR)a-7亞型是迷走神經(jīng)激活的“膽堿能抗炎通路”的一個重要成分，激活a7nAChR可以明顯抑制TNF-a、IL-1、IL-6、高遷移率族蛋白B1(HGMB1)等致炎因子的產(chǎn)生，促進TGF-后、IL-10等抗炎因子的產(chǎn)生。兩種機制同時激活起到協(xié)同抗炎的作用。a7nAChR的特異性激動劑尼古丁（Nicotine)比乙酰膽堿更有效地抑制促炎癥因子TNF-a、IL-1、IL-6、HGMB1的釋放和抗炎因子TGF-后、IL-10的產(chǎn)生[5’6]。 目前尚無研宄報道證實間充質(zhì)干細表面是否表達a7nACHR，也沒有相關(guān)研宄報道證實尼古丁可通過a7nACHR調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細胞的功能。本研宄首次證實了間充質(zhì)干細表面表達a7nACHR。尼古丁是a7nACHR的特異性激動劑，并且首次證實了經(jīng)小劑量尼古丁預(yù)處理的MSCs的免疫調(diào)節(jié)抗炎功、增殖能力、遷徙能力及粘附能力增強。為MSCs應(yīng)用于MODS的治療提供了新的理論依據(jù)。 本研宄分為二部分，第一：從人臍帶分離間充質(zhì)干細胞，并進行鑒定及檢測其增殖及誘導(dǎo)分化能力；第二：通過Western blot技術(shù)證明間充質(zhì)干細胞表面表達a7nACHR0尼古丁是a7nACHR的特異性激動劑，經(jīng)小劑量尼古丁預(yù)處理的人臍帶間充質(zhì)干細胞與植物血凝集素刺激的人外周血單核細胞共培養(yǎng)，抑制植物血凝集素刺激的外周血單核細胞釋放促炎癥因子TNF-a，并促進植物血凝集素刺激的外周血單核細胞釋放抗炎因子IL-10。經(jīng)小劑量尼古丁預(yù)處理的間充質(zhì)干細胞的增殖能力、遷徙能力及粘附能力增強。但是隨著尼古丁劑量的增加，MSCs的能力呈現(xiàn)衰減趨勢，提示大劑量尼古丁可能對MSCs產(chǎn)生了毒性作用。 第一部分臍帶間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定 目的：從人臍帶中分離并體外培養(yǎng)擴增間充質(zhì)干細胞，鑒定并檢測其增殖及誘導(dǎo)分化能力。 方法：采用組織微塊貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細胞，在固定時間內(nèi)進行消化、傳代和擴增。通過倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)學(xué)特征、透射電鏡觀察細胞的超微結(jié)構(gòu)、流式細胞儀技術(shù)、成骨細胞誘導(dǎo)、成脂肪細胞誘導(dǎo)等方法鑒定其為正在分化的間充質(zhì)干細胞。 結(jié)果：采用人臍帶微組織塊貼壁培養(yǎng)法分離，培養(yǎng)的細胞表現(xiàn)為成纖維細胞樣外觀的長梭形，單核，有較長的突起，貼壁生長，融合度較高的細胞呈漩渦狀生長。流式細胞儀鑒定細胞表面CD29、CD44、CD90、CD105高表達，不表達CD34、CD45、HLA-DR。間充質(zhì)干細胞可以分化為成骨細胞及成脂肪細胞。 結(jié)論：以人臍帶來源可以分離培養(yǎng)出間充質(zhì)干細胞，，且細胞數(shù)量穩(wěn)定，具有典型間充質(zhì)干細胞形態(tài)特點，具有分化為成骨細胞及成脂肪細胞的潛能。為下一步的研宄提供技術(shù)支持。 第二部分：尼古丁通過a7nACHR調(diào)節(jié)人臍帶間充質(zhì)干細胞功能的研究 目的：證明人臍帶間充質(zhì)干細胞表面表達a7nACHR。尼古丁是a7nACHR的特異性激動劑，分析經(jīng)尼古丁預(yù)處理后人臍帶間充質(zhì)干細胞免疫調(diào)節(jié)功能、增殖能力、遷徙能力及粘附功能力的變化，為進一步探討間充質(zhì)干細胞在臨床相關(guān)疾病中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 方法：應(yīng)用western blot技術(shù)鑒定間充質(zhì)干細胞表面表達a7nACHR。取生長狀態(tài)良好的P3代間充質(zhì)干細胞，隨機分為6組，標(biāo)記為A、B、C、D、E、F,依次加入（0、10umol/L、15umol/L20umol/L50umol/L)6種濃度的尼古丁預(yù)處理2h，然后分別消化間充質(zhì)干細胞，按照每孔lx W5個細胞接種于24孔培養(yǎng)板中。經(jīng)供者授權(quán)同意后，無菌條件下采集健康供者外周靜脈血10ml。分離人外周血單個核細胞，待間充質(zhì)干細胞貼壁后，每孔加入2xl06個人外周血單個核細胞及2ul植物血凝集素(10mg/L),共培養(yǎng)72h后，離心采集上清。用ELISA檢測培養(yǎng)上清中TNF-a和IL-10的表達水平。取生長狀態(tài)良好的P3代間充質(zhì)干細胞，隨機分為6組，標(biāo)記為A、B、C、D、E、F，依次加入（0、10umol/L、15umol/L20umol/L50umol/L)6種濃度的尼古丁預(yù)處理2h后，消化接種于24孔板檢測其增殖能力。取生長狀態(tài)良好的P3代間充質(zhì)干細胞，隨機分為6組，標(biāo)記為A、B、C、D、E、F，依次加入（0、10umol/L、15umol/L、20umol/L、50umol/L)6種濃度的尼古丁預(yù)處理2h后，檢測其遷徙能力及粘附功能。 結(jié)果：Westenr blot結(jié)果提示間充質(zhì)干細胞表面表達a7nACHR。ELISA法檢測結(jié)果提示經(jīng)小劑量尼古丁預(yù)處理的人臍帶間充質(zhì)干細胞與植物血凝集素刺激的人外周血單核細胞共培養(yǎng)，抑制植物血凝集素刺激的外周血單核細胞釋放促炎癥因子TNF-a,并促進植物血凝集素刺激的外周血單核細胞釋放抗炎因子IL-10。經(jīng)小劑量尼古丁預(yù)處理的間充質(zhì)干細胞的增殖能力、遷徙能力及粘附能力增強。但是隨著尼古丁劑量的增加，MSCs的能力呈現(xiàn)衰減趨勢，提示大劑量尼古丁可能對MSCs產(chǎn)生了毒性作用。 結(jié)論：間充質(zhì)干細胞表面表達a7nACHR，經(jīng)小劑量a7nACHR的特異性激動劑尼古丁預(yù)處理后的間充質(zhì)干細胞免疫調(diào)節(jié)功能、增殖能力、遷徙能力及粘附功能增強。 小結(jié)：組織細胞的凋亡與壞死以及全身炎癥反應(yīng)綜合癥是MODS的發(fā)病基礎(chǔ)。間充質(zhì)干細胞能在體內(nèi)長期存活并在局部微環(huán)境誘導(dǎo)下歸巢到損傷部位，間充質(zhì)干細胞的免疫調(diào)節(jié)功能可以抑制植物血凝集素刺激的外周血單核細胞促炎因子的釋放，促進抗炎因子的產(chǎn)生，進而參與SIRS及MODS的炎癥調(diào)節(jié)。間充質(zhì)干細胞應(yīng)用于MODS的預(yù)防和治療具有良好的前景，間充質(zhì)干細胞表面表達a7nACHR。尼古丁是a7nACHR的特異性激動劑，小劑量尼古丁可以增強間充質(zhì)干細胞的免疫調(diào)節(jié)功能，增殖能力、遷徙能力及粘附功能力，進而可以提高間充質(zhì)干細胞治療MODS的有效性。但是隨著尼古丁劑量的增加，MSCs的能力呈現(xiàn)衰減趨勢，提示大劑量尼古丁可能對MSCs產(chǎn)生了毒性作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R459.7

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本文編號：1599691