發(fā)布時間：2018-03-05 11:22

  本文選題：人肝再生增強(qiáng)子　切入點(diǎn)：單克隆抗體　出處：《浙江大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景 在我國,病毒性肝炎尤其是慢性乙型肝炎感染率及發(fā)病率高,肝衰竭成為慢性肝病患者的主要死亡原因之一。肝衰竭的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的差異性與肝細(xì)胞的凋亡及再生相關(guān),一系列的復(fù)雜因素包括大量肝細(xì)胞壞死、凋亡及退化參與其中。肝再生是一個十分復(fù)雜的過程,一系列細(xì)胞因子包括肝細(xì)胞生長因子、表皮生長因子、轉(zhuǎn)移生長因子及胰島素等。但上述細(xì)胞因子均無法解釋器官特異性肝細(xì)胞再生。人肝再生增強(qiáng)因子(hALR)是最新發(fā)現(xiàn)的一種與肝再生密切相關(guān)的細(xì)胞因子,研究表明hALR是目前已知唯一對肝源性細(xì)胞有特異性增殖刺激活性的因子,能顯著促進(jìn)肝細(xì)胞再生。在非激活狀態(tài)下ALR在肝細(xì)胞中低水平持續(xù)表達(dá),而當(dāng)肝細(xì)胞收到損傷肝再生過程啟動時,ALR表達(dá)量大大增加并從肝細(xì)胞內(nèi)釋放入血。有動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在肝再生早期外周血ALI泳平即有明顯上升且較其它肝再生相關(guān)的細(xì)胞因子早,血清ALR水平良好反映肝臟ALR表達(dá)水平及肝臟再生情況。本研究通過重組克隆制備獲得高純度hALR蛋白及抗hALR單克隆抗體,通過免疫組化、定量PCR及ELISA等方法比較不同類型及不同預(yù)后慢性肝病(包括肝衰竭、肝癌、慢性乙型肝炎等)患者肝組織hALR分布、mRNA表達(dá)水平及血清hALR表達(dá)水平差異,以及同一肝衰竭患者不同疾病發(fā)展階段hALR水平變化,進(jìn)一步闡明hALR在肝細(xì)胞再生中的可能作用機(jī)制,探討hALR在肝衰竭發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸中的地位及意義。 方法 以肝移植正常人供肝總mRNA為模板,以RT-PCR獲取全長hALR cDNA,構(gòu)建合成蛋白標(biāo)簽、蛋白酶切位點(diǎn)及分泌信號肽序列,然后將hALR.蛋白標(biāo)簽、蛋白酶切位點(diǎn)及原核表達(dá)用分泌信號肽以一定的連接順序同時克隆到E.coli表達(dá)載體pET28a(+)中,轉(zhuǎn)化E.coli BL21,制備工程菌,摸索誘導(dǎo)表達(dá)條件,避免形成大量包涵體,使hALR以分泌蛋白的形式在大腸桿菌中得以高表達(dá),然后利用陰離子交換層析、陽離子交換層析和分子篩等技術(shù),純化重組hALR,使制備的重組hALR純度在98%以上。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和免疫印跡(Western-Blot)等方法,利用重組蛋白上帶有的蛋白標(biāo)簽,鑒定特異性目的蛋白的表達(dá)。用相應(yīng)的蛋白酶切去蛋白重組多肽后獲取天然結(jié)構(gòu)hALR蛋白,利用免疫共沉淀和質(zhì)譜技術(shù),對重組hALR的分子量、等電點(diǎn)等生物學(xué)性狀進(jìn)行鑒定。 以hALR蛋白為抗原腹腔注射免疫Balb/c小鼠,以Balb/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作為滋養(yǎng)細(xì)胞,將小鼠脾細(xì)胞與SP2/O細(xì)胞混合接種,采用間接ELISA篩選分泌抗hALR抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞株,將雜家瘤細(xì)胞腹腔接種于腹水小鼠,抽取腹水-20。C保存。用hALR蛋白以western-b1ot的方法鑒定與單克隆抗體的特異性結(jié)合。以不同細(xì)胞因子包被進(jìn)行間接ELISA檢測,排除單克隆抗體的交叉反應(yīng)。 入選臨床病例,獲得知情同意后用肝穿刺活檢的方法獲取肝組織,部分接受原位肝移植的肝衰竭患者可獲取其肝組織分切成小塊,固定后臘塊包埋保存,部分凍存于液氮罐。同時在其疾病的第1、3、7、14及21天抽取外周血,離心后將上清分別凍存于-20℃。將hALR蛋白稀釋成一系列濃度,與hALR單克隆抗體以Elisa方法制作hALR濃度與吸光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線,參照標(biāo)準(zhǔn)曲線,以ELISA的方法檢測外周血hALR水平,將臘塊包埋的肝組織切片,常規(guī)制片后脫蠟,羊血清封閉,一抗為抗hALR抗體,二抗為HRP標(biāo)記兔抗鼠IgG,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,顯微鏡下觀察并拍照,同時設(shè)立陰性對照制片,觀察hALR在肝組織內(nèi)分布情況。用real-time PCR的方法檢測肝組織內(nèi)ALRmRNA表達(dá)水平,β-actin mRNA水平被用來衡量不同批次nRNA的cDNA合成及逆轉(zhuǎn)錄效率。 結(jié)果 獲取全長375kb的ALR cDNA并成功克隆于pET-28a (+),表達(dá)、純化、鑒定hALR蛋白,純化的ALR質(zhì)譜法檢測ALR分子量24.712KD,等電點(diǎn)為4.63,并成功獲取抗hALR單克隆抗體。定量PCR結(jié)果顯示ALR mRNA在肝癌組織中高表達(dá)(10E6.24(1.74×106) copies/μl),在肝衰竭惡化接受肝移植組低表達(dá)(10E3.45(2.82×103) copies/μl),在正常人肝組織中低表達(dá)(10E4.31(2.04×104) copies/μl). Elisa研究血清ALR表達(dá)水平結(jié)果顯示：血清ALR水平肝衰竭肝功能好轉(zhuǎn)組(1613.5±369.6pmol/ml)顯著高于肝衰竭肝功能惡化組(462.3±235.8pmol/ml).原發(fā)性肝癌組(917.9±332.7pmol/ml)、慢性乙型肝炎組(969.2±332.5pmol/ml)及正常人對照組(806.9±240.8pmol/ml)血清AL＆水平接近,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論 在肝衰竭患者中,血清ALR水平的高低反映了肝臟再生程度的高低。高的血清ALR水平提示肝臟再生活躍而預(yù)后較好。低的血清ALR水平提升肝臟再生差而導(dǎo)致死亡或必須接受肝移植。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R575.3

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本文編號：1570051