發(fā)布時(shí)間：2017-09-29 10:21

  本文關(guān)鍵詞：針對(duì)人NeuroD基因RNA干擾慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定

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【摘要】：目的構(gòu)建并鑒定人神經(jīng)源性分化蛋白基因(NeuroD)RNA干擾慢病毒表達(dá)載體。方法根據(jù)已公布的NeuroD基因序列(GenBank:NM_002500),設(shè)計(jì)并合成4對(duì)shRNA(NeuroD1~D4),與載體pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR連接,構(gòu)建pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-NeuroD表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞DH5α;real-time PCR技術(shù)檢測(cè)pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-NeuroD表達(dá)載體對(duì)293T細(xì)胞內(nèi)靶基因的干擾效果。將篩選出的干擾載體pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-NeuroD1與慢病毒載體pLenti6.3/V5-DEST經(jīng)酶切后連接,構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體pLenti6.3-EGFP-NeuroD1-miR。用構(gòu)建的慢病毒表達(dá)載體和包裝質(zhì)粒(Packaging Mix)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,包裝病毒,收集病毒原液,超速離心濃縮,并測(cè)定滴度。采用PCR法對(duì)重組載體進(jìn)行鑒定,利用綠色熒光蛋白作為報(bào)告基因,對(duì)病毒滴度和感染效率進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果成功構(gòu)建針對(duì)靶基因的4個(gè)干擾質(zhì)粒,測(cè)序結(jié)果表明,4個(gè)pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-NeuroD表達(dá)載體序列與參考序列一致,real-time PCR檢測(cè)顯示以pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-NeuroD1的沉默效應(yīng)最佳(P0.01)。將重組獲得的慢病毒表達(dá)載體pLenti6.3-EGFP-NeuroD1-miR轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞株,酶切鑒定及PCR結(jié)果與病毒載體的預(yù)期一致,病毒滴度達(dá)1.18×108 ifu/mL。結(jié)論成功構(gòu)建、篩選了針對(duì)人NeuroD基因的RNA干擾慢病毒表達(dá)載體。
【作者單位】： 第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院病理科;
【關(guān)鍵詞】： 慢病毒 NeuroD基因 RNA干擾 胰腺腫瘤
【基金】：國家自然科學(xué)基金(30770996,81172310) 長(zhǎng)海醫(yī)院“1255學(xué)科建設(shè)計(jì)劃”(CH125521106)~~
【分類號(hào)】：R346
【正文快照】： 神經(jīng)源性分化蛋白(neurogenic differentiation,NeuroD)最早是通過酵母雙雜交分析系統(tǒng)克隆出的一個(gè)堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)家族成員[1],其基因位于2q32,在神經(jīng)分化和發(fā)育過程中起著重要作用,還參與胰腺的發(fā)育和胰島B細(xì)胞的分化[2],是一種含bHLH結(jié)構(gòu)域

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 胡玲;孫崇奎;茍雅萍;李燕;肖麗英;;shRNA慢病毒對(duì)人口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞端粒酶卡侯體蛋白1基因的沉默效應(yīng)[J];國際口腔醫(yī)學(xué)雜志;2013年06期

2 周鵬;高洋;杜紅延;李紅衛(wèi);;慢病毒載體——重組蛋白高效表達(dá)的新契機(jī)[J];分子診斷與治療雜志;2013年06期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 陳玲;RNA干擾α-突觸核蛋白基因表達(dá)對(duì)甲基苯丙胺神經(jīng)毒性的影響及其機(jī)制[D];南方醫(yī)科大學(xué);2012年

2 張菊;神經(jīng)干細(xì)胞Ankrd17蛋白和MCMV嗜神經(jīng)蛋白M122相互作用與胎腦發(fā)育異常機(jī)制[D];華中科技大學(xué);2013年

3 邱陽;WIG-1對(duì)人食管鱗癌細(xì)胞系順鉑敏感性的影響及其機(jī)制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2013年

4 馬杰;RNA基因干擾技術(shù)抑制草魚呼腸孤病毒復(fù)制的研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

5 鄧海軍;MicroRNA-338-3p前體及其抑制劑的慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建和初步功能性分析[D];南方醫(yī)科大學(xué);2013年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 闞艷艷;RNA干擾抑制PARP-1基因表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖及耐藥性的影響[D];山東大學(xué);2011年

2 江晨;水稻兩個(gè)osvdac基因干涉載體的構(gòu)建及其遺傳轉(zhuǎn)化[D];中南民族大學(xué);2011年

3 崔力;抑制瞬時(shí)受體電位M7通道表達(dá)對(duì)人牙髓干細(xì)胞增殖、遷移及成骨/成牙向分化的影響[D];南方醫(yī)科大學(xué);2013年

4 劉文丹;慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾沉默HMGA2對(duì)HL-60細(xì)胞增殖及CCNB2、CCNA2表達(dá)的影響[D];廣州醫(yī)學(xué)院;2012年

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 梁英;吳偉忠;李薇薇;張寧;孫惠川;王魯;夏景林;;靶向Arnt的RNAi慢病毒載體的構(gòu)建及其在HCCLM6中對(duì)Arnt基因表達(dá)的影響[J];中國臨床醫(yī)學(xué);2008年06期

2 王延洲;梁志清;劉曉芳;徐惠成;;Smad3基因RNAi慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2009年08期

3 李玉紅;宋文濤;廖漢林;畢勇毅;;CYP4F3基因RNA干擾重組慢病毒載體的構(gòu)建[J];江蘇醫(yī)藥;2011年14期

4 王玉川;劉正娟;趙永利;閆冬;汪曉霞;;大鼠瘦素受體RNAi慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定[J];大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2009年01期

5 包杰;王前;鄭磊;曾方銀;劉杰;熊石龍;裘宇容;李娟;;小鼠RelB基因RNAi慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2007年06期

6 萬赤丹;程銳;王春友;王宏博;王帥;劉濤;;解偶聯(lián)蛋白-2 RNA干擾慢病毒載體的構(gòu)建[J];中國康復(fù);2008年05期

7 降風(fēng);王雪貞;卜碧濤;張?zhí)K明;張e，

本文編號(hào)：941454