本文關(guān)鍵詞：日本血吸蟲Vasa3基因定位與功能的初步研究

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【摘要】：目的:利用原位雜交技術(shù)對日本血吸蟲各期蟲體進行整蟲基因定位,初步判斷Vasa3在日本血吸蟲生殖系統(tǒng)發(fā)育中的作用;應用RNA干擾技術(shù)揭示Vasa3基因在血吸蟲生殖、發(fā)育中所具有的功能;通過本研究期望發(fā)現(xiàn)可干預和抑制血吸蟲生殖發(fā)育的關(guān)鍵靶標,為研發(fā)抑制血吸蟲蟲卵發(fā)育及活性的藥物或制劑提供理論和實驗依據(jù),探索控制血吸蟲病流行和減輕血吸蟲對人體危害新途徑。方法:利用BLAST軟件,篩選特異性序列作為Vasa3基因原位雜交RNA探針片段,以血吸蟲成蟲cDNA為模板,普通PCR擴增獲得314 bp特異性片段,重組到pspT-18載體,體外轉(zhuǎn)錄合成地高辛反義RNA探針。對日本血吸蟲24、36、及42天成蟲通過漂白、透膜、雜交、顯色等處理后,封片觀察。以Vasa3為靶基因,合成3個不同靶區(qū)域的siRNA(V1,V2和V3),實驗結(jié)果確定有效靶點后,構(gòu)建包裝表達shRNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒的質(zhì)粒載體,與PVSVG質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染GP2-293細胞后,48h收取細胞上清,通過超速離心法濃縮病毒,Retro-X qRT-PCR Titration Kit進行病毒滴定。用針對日本血吸蟲Vasa3 shRNA的病毒感染日本血吸蟲18天成蟲,分別在RNA干擾后7天觀察Vasa3基因及蛋白表達水平,于14天通過激光共聚焦顯微鏡觀察生殖系統(tǒng)形態(tài)學變化。結(jié)果:通過整蟲原位雜交,在日本血吸蟲24、36及42天雌蟲卵巢和卵黃腺可見強烈雜交陽性信號,在雄蟲中未見明顯陽性信號,由此結(jié)果顯示Vasa3基因在雌蟲卵巢和卵黃腺高表達。siRNA篩選結(jié)果顯示V2組靶序列(5’-cuaaacgcggagcugauautt-3’)具有較好的干擾效果,以此序列成功構(gòu)建含人U6啟動子的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體PLNHX_HsU6_Vasa3。與PVSVG質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染GP2-293細胞后,成功包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒并測定滴度為5×107cfu/ml。感染日本血吸蟲后RT-PCR顯示Vasa3基因水平較對照組下降69%。激光共聚焦顯微鏡觀察蟲體生殖系統(tǒng)形態(tài)結(jié)果顯示與對照組相比,實驗組雄蟲睪丸變小,包膜不規(guī)整,睪丸內(nèi)細胞形態(tài)雜亂,分界不清。雄蟲卵巢內(nèi)細胞減少,細胞分界不清,結(jié)構(gòu)紊亂。結(jié)論:本課題首先通過Vasa3在生殖系統(tǒng)定位的明確,初步證實Vasa3可能參與血吸蟲雌蟲生殖器官的發(fā)育并可做為雌性生殖系統(tǒng)的分子標志。再通過小RNA分子干擾技術(shù),體外驗證消減該基因表達的靶標區(qū)域。最后將Vasa3干擾有效靶標區(qū)域整合入表達發(fā)夾RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒,用該病毒感染血吸蟲,達到能較長期抑制Vasa3基因的表達,明確該基因在血吸蟲生殖系統(tǒng)發(fā)育中的功能。通過對Vasa3基因的研究,有助于探索控制血吸蟲病流行和減輕血吸蟲對人體危害的新途徑。此方法為長效抑制日本血吸蟲的基因表達、鑒定其功能提供一種可靠的方法。
【關(guān)鍵詞】：日本血吸蟲 Vasa3基因 基因定位 RNA干擾
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R383.2
【目錄】：

• 中英文縮略詞對照表7-8
• 中文摘要8-10
• ABSTRACT10-12
• 1 前言12-15
• 2 材料與方法15-32
• 2.1 材料15-19
• 2.1.1 主要軟件15
• 2.1.2 菌株、質(zhì)粒和細胞15
• 2.1.3 實驗動物15
• 2.1.4 主要試劑及試劑盒15-16
• 2.1.5 部分試劑的配置方法16-18
• 2.1.6 主要儀器18-19
• 2.2 實驗方法19-32
• 2.2.1 Sj Vasa3基因整蟲原位雜交19-24
• 2.2.1.1 Sj Vasa3基因特異性片段獲取19-20
• 2.2.1.2 psp T-19+Sj Vasa3重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定20
• 2.2.1.3 體外轉(zhuǎn)錄制備DIG-m RNA探針20-21
• 2.2.1.4 單酶切使模板線性化21-22
• 2.2.1.5 合成探針22
• 2.2.1.6 日本血吸蟲整蟲原位雜交22-24
• 2.2.2 si RNA干擾篩選消減Sj Vasa3基因表達的有效片段24-26
• 2.2.2.1 從三個si RNA中篩選最佳片段24
• 2.2.2.2 si RNA干擾18天成蟲24-25
• 2.2.2.3 RT-PCR檢測si RNA干擾效果25-26
• 2.2.3 表達Sj Vasa sh RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝及滴度測定26-31
• 2.2.3.1 構(gòu)建Sj Vasa3 sh RNA表達質(zhì)粒26-28
• 2.2.3.2 GP2-293細胞培養(yǎng)28-29
• 2.2.3.3 逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝29-31
• 2.2.3.4 病毒滴定31
• 2.2.4 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染日本血吸蟲31
• 2.2.4.1 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染18天成蟲31
• 2.2.5 逆轉(zhuǎn)錄病毒干擾效果測定31-32
• 2.2.5.1 熒光定量檢測Sj Vasa3基因表達水平31
• 2.2.5.2 激光共聚焦顯微鏡觀察日本血吸蟲成蟲生殖系統(tǒng)形態(tài)學變化31-32
• 3 實驗結(jié)果32-42
• 3.1 Sj Vasa3的命名32-33
• 3.2 原位雜交實驗結(jié)果33-39
• 3.2.1 體外轉(zhuǎn)錄合成DIG-RNA探針33-34
• 3.2.2 日本血吸蟲 24、36、42天成蟲原位雜交結(jié)果34-39
• 3.3 RNA干擾39-42
• 3.3.1 篩選RNAi干擾靶點結(jié)果39
• 3.3.2 成功構(gòu)建含PLNHX_Hs U6_Vasa39-40
• 3.3.3 日本血吸蟲RNA干擾后Sj Vasa3基因水平變化40-41
• 3.3.4 日本血吸蟲RNA干擾后對蟲體及產(chǎn)卵影響41
• 3.3.5 日本血吸蟲RNA干擾后共聚焦觀察形態(tài)學的變化。41-42
• 4.討論42-46
• 4.1 原位雜交結(jié)果分析42-44
• 4.2 RNA干擾方法選擇44-45
• 4.3 RNA干擾結(jié)果討論45-46
• 5.結(jié)論46
• 參考文獻46-54
• 個人簡歷54-55
• 致謝55-56
• 綜述56-69
• 參考文獻63-69

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