本文關(guān)鍵詞：Calretinin調(diào)節(jié)睪丸間質(zhì)細(xì)胞雄激素生成及其機(jī)制的研究

  更多相關(guān)文章： Calretinin 睪丸間質(zhì)細(xì)胞 雄激素 Ca~(2+) 凋亡

【摘要】：研究背景和目的：睪丸主要作用是生成精子和合成雄激素,前者完成于生精小管,后者由睪丸間質(zhì)細(xì)胞(Leydig cells)完成。雄激素的合成和分泌受到下丘腦-垂體-性腺軸(HPG)的調(diào)控。黃體生成激素(LH)結(jié)合其受體(LHR),激活環(huán)化腺苷酶,將ATP轉(zhuǎn)化為cAMP,激活蛋白激酶A(PKA)通路；激活磷脂酶C(PLC),將磷脂酰肌醇分為二酰甘油(DAG)和三磷酸肌醇(IP3),激活PKC通路。兩者促進(jìn)急性類固醇激素生成急性調(diào)節(jié)蛋白(STAR)和其它類固醇激素生成酶,促進(jìn)雄激素的合成。IP3激活肌漿網(wǎng)鈣池,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子增多,與DAG共同作用；Ca2+作為第二信使參與調(diào)節(jié)雄激素的合成。此外,還受到睪丸局部旁分泌和自分泌調(diào)節(jié)如胰島素樣生長因子、甲狀腺激素、白細(xì)胞介素-1(IL-1)、促細(xì)胞分裂因子、腫瘤壞死因子(TNF)等。因此,睪丸間質(zhì)細(xì)胞雄激素的合成受到內(nèi)分泌、自分泌和旁分泌因子的復(fù)雜網(wǎng)路的調(diào)節(jié)。鈣視網(wǎng)膜蛋白(calretinin)是一種鈣結(jié)合蛋白,主要表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)中,也在卵巢、睪丸中存在。Calretinin主要作用是緩沖細(xì)胞內(nèi)的鈣離子(Ca2+)濃度,防止Ca2+超載,也可作為Ca2+感受器發(fā)揮作用而Ca2+參與調(diào)節(jié)雄激素合成。課題組前期研究表明,calretinin在大鼠間質(zhì)細(xì)胞質(zhì)中表達(dá),且在成年期大鼠間質(zhì)細(xì)胞calretinin表達(dá)最高；以間質(zhì)細(xì)胞系為模型,calretinin超表達(dá)后,間質(zhì)細(xì)胞睪酮生成增多。提示我們calretinin作為間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的因子參與調(diào)節(jié)雄激素合成。綜上,我們認(rèn)為calretinin作為間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的因子,可影響細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度,通過PKC等通路促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞雄激素的合成。Calretinin也可以通過促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞增殖、抑制凋亡作用間接促進(jìn)睪丸雄激素合成的功能。為驗(yàn)證以上科研假說,本研究以二種睪丸間質(zhì)細(xì)胞系為模型,研究calretinin對間質(zhì)細(xì)胞雄激素合成的作用及其機(jī)制。材料與方法：(1)驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建的LV-calb2和LV-siRNA-calb2慢病毒,分別轉(zhuǎn)染小鼠間質(zhì)細(xì)胞系(MLTC-1)和大鼠間質(zhì)細(xì)胞系(R2C),通過免疫熒光技術(shù)、Western blot方法證明轉(zhuǎn)染病毒表達(dá)的有效性；(2)培養(yǎng)MLTC-1、R2C細(xì)胞,分別轉(zhuǎn)染LV-calb2和LV-siRNA-calb2慢病毒載體,體外培養(yǎng)96h,用流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡；(3)MLTC-1、R2C細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染LV-calb2和LV-siRNA-calb2慢病毒載體,Western blot觀察增殖及凋亡相關(guān)因子：AKT、p-AKT、Bcl2、Bax、cytochromeC、 cleaved-caspase3/9、caspase-3/9、cleaved-PARP、PARP的改變；(4)LV-siRNA-calb2慢病毒載體轉(zhuǎn)染R2C細(xì)胞,體外培養(yǎng)96h,放射免疫法測定血清孕酮水平；(5)R2C細(xì)胞轉(zhuǎn)染LV-siRNA-calb2慢病毒載體,Western blot方法觀察調(diào)節(jié)間質(zhì)細(xì)胞雄激素合成的PKC信號通路相關(guān)蛋白如PLC、p-PKCμ (PKD)、PKD、 p-MARCKS、MARCKS、CREB、STAR的變化；(6)MLTC-1、R2C細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染LV-calb2和LV-siRNA-calb2慢病毒載體,并用鈣離子探針X-Rhod-1標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)Ca2+,共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)Ca2+的變化；(7)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Means計(jì)學(xué)處)表示,獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析。P0.05代表統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異。結(jié)果：(1)LV-calb2慢病毒感染MLTC-1細(xì)胞96小時(shí)后,與對照組比較,calretinin表達(dá)上調(diào)2-3倍(p0.001)。LV-siRNA-calb2感染R2C細(xì)胞,calretinin表達(dá)下降(p0.05),干涉效率達(dá)60-70%左右。這表明LV-calb2和LV-siRNA-calb2慢病毒是高效的。(2)超表達(dá)calretinin后,MLTC-1細(xì)胞凋亡率減少(p0.001),而干涉calretinin后R2C細(xì)胞凋亡率增加(p0.05)。(3)超表達(dá)calretinin后,MLTC-1細(xì)胞p-AKT、Bcl2/Bax比值增多(P0.05),而cytochromeC、cleaved-caspase3/9、caspase-3/9、cleaved-PARP、PARP表達(dá)減少(p0.05),AKT表達(dá)不變(p0.05)；干涉calretinin后,R2C表達(dá)p-AKT、Bcl2/Bax比值減少,而cytochromeC(p0.05)、 cleaved-caspase3/9、 caspase-3/9、 cleaved-PARP、PARP增多,AKT表達(dá)不變。(4)干涉calretinin后,R2C的細(xì)胞分泌孕酮減少(p0.05)。(5)干涉calretinin后,PKC通路的信號分子PLC、p-PKD、p-MARCKS、MARCKS、 CREB,STAR表達(dá)減少(p0.05),PKD表達(dá)不變(p0.05)。(6)超表達(dá)calretinin后,細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+水平增高(p0.05)；干涉calretinin后細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平減少(p0.01)。結(jié)論：(1)Calretinin促進(jìn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞類固醇激素的合成。(2)Calretinin作為間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的因子,通過PLC-Ca2+-PKC信號通路參與調(diào)節(jié)類固醇激素合成。(3)Calretinin促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞的增殖,抑制睪丸間質(zhì)細(xì)胞的凋亡,其機(jī)制可能是通過加強(qiáng)PI3K-AKT和ERKl/2信號促進(jìn)細(xì)胞增殖,而PI3K-AKT和ERK1/2信號也可抑制線粒體凋亡通路,從而抑制間質(zhì)細(xì)胞的凋亡。提示calretinin對間質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)性作用,并間接促進(jìn)睪丸內(nèi)雄激素的合成。(4)本研究證明calretinin參與調(diào)節(jié)睪丸雄激素合成及睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖與凋亡,并闡明其作用機(jī)制。這對于進(jìn)一步闡明間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的分子調(diào)節(jié)機(jī)制具有重要理論意義,對于遲發(fā)型性腺功能減退癥(LOH)等男性性腺功能減退疾病等具有臨床研究與治療的意義。
【關(guān)鍵詞】：Calretinin 睪丸間質(zhì)細(xì)胞 雄激素 Ca~(2+) 凋亡
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R339.2
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-12
• 前言12-15
• 材料與方法15-25
• 結(jié)果25-34
• 討論34-43
• 結(jié)論43-44
• 參考文獻(xiàn)44-50
• 文獻(xiàn)綜述（一）50-60
• 參考文獻(xiàn)56-60
• 文獻(xiàn)綜述（二）60-73
• 參考文獻(xiàn)68-73
• 英漢縮略語名詞對照73-75
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表文章情況75-76
• 致謝76

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