本文關(guān)鍵詞：中華絨螯蟹重要過敏原—血藍蛋白的抗原表位分析、重組表達及鑒定

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【摘要】：目的:蟹體內(nèi)含有多種蛋白質(zhì),每種蛋白質(zhì)均可能成為過敏原;同時,前期結(jié)果已證實,不同蟹過敏患者之間的過敏原組分具有明顯的異質(zhì)性。因此,單組分分析逐漸成為制備用于蟹過敏患者體外診斷和個體化治療的標(biāo)準化抗原的基礎(chǔ)。本研究希望找到蟹中未引起重視的過敏原,證實該過敏原在中華絨螯蟹過敏中起重要作用;同時,從分析過敏原的主要抗原表位入手,構(gòu)建關(guān)鍵抗原表位串聯(lián)體并評估其免疫活性,探討用該重組蛋白代替天然蛋白用于中華絨螯蟹過敏患者體外診斷和個體化治療的可能。方法:1.血藍蛋白是中華絨螯蟹中一種重要的高分子量過敏原:采用裂解液法提取獲得中華絨螯蟹總蛋白,通過SDS-PAGE、二維(2-D)電泳及Western blot技術(shù)分析蛋白提取液中的過敏原組分,再通過質(zhì)譜技術(shù)鑒定蟹中未知的過敏原。以臨床蟹過敏患者的血清sIgE作為識別抗體,通過斑點免疫印跡實驗檢測疑似蛋白的反應(yīng)頻率,證明該疑似蛋白是中華絨螯蟹中一種重要的高分子量過敏原。2.血藍蛋白抗原表位分析及關(guān)鍵抗原表位篩選:通過三種線性抗原表位預(yù)測軟件(DNAstar Protean system,ABCpred和Bepipred Antibody Epitope Prediction)分析血藍蛋白中可能的抗原表位,篩選有重疊的肽段作為候選抗原表位,然后采用斑點印跡的方法,以14例蟹過敏患者血清作為一抗,分析候選抗原表位的反應(yīng)頻率,并篩選反應(yīng)頻率最高的三段抗原表位作為關(guān)鍵抗原表位。3.關(guān)鍵抗原表位串聯(lián)體的構(gòu)建及免疫學(xué)活性鑒定:將編碼關(guān)鍵抗原表位的DNA序列進行串聯(lián),并構(gòu)建到pET-28a質(zhì)粒中,然后,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Rosetta感受態(tài)細胞中,進行目的蛋白的異源表達,之后利用鎳柱純化獲得目的重組蛋白。同時,重組表達中華絨螯蟹的全長血藍蛋白,用于關(guān)鍵抗原表位串聯(lián)體的免疫學(xué)活性鑒定。最后,采用SDS-PAGE、Western Blot鑒定目的重組蛋白,并通過ELISA、斑點抑制實驗及ELISA抑制試驗評估目的重組蛋白的免疫學(xué)活性。結(jié)果:1.血藍蛋白是中華絨螯蟹中一種重要的高分子量過敏原:通過SDS-PAGE及2-D電泳的結(jié)果分析,證明本實驗所提取的中華絨螯蟹總蛋白組分完整。Western blot結(jié)果顯示,中華絨螯蟹總蛋白提取液中至少有18種能與陽性血清反應(yīng)的蛋白組分。其中,分子量為70~80 kDa之間的兩個蛋白處于同一等電點,可能為同一種蛋白質(zhì),且均能與陽性患者血清反應(yīng),是中華絨螯蟹中的過敏組分。質(zhì)譜分析結(jié)果顯示兩個疑似蛋白均為中華絨螯蟹的血藍蛋白。斑點免疫印跡結(jié)果顯示血藍蛋白與過敏患者血清的反應(yīng)頻率為61%,證明血藍蛋白是中華絨螯蟹中一種重要的高分子量過敏原。2.血藍蛋白抗原表位分析:利用抗原表位預(yù)測軟件篩選獲得10條候選抗原表位。在斑點印跡實驗中,所篩選的10條候選表位肽段均能與至少一例陽性血清反應(yīng)。我們將各候選表位與sIgE的反應(yīng)頻率進行統(tǒng)計,只有表位E1、E2和E4的反應(yīng)頻率大于40%,我們篩選1、2、4號抗原表位作為關(guān)鍵抗原表位。3.關(guān)鍵抗原表位串聯(lián)體的構(gòu)建及免疫學(xué)活性鑒定:將篩選獲得的3個關(guān)鍵抗原表位串聯(lián)表達及純化后,獲得的目的重組蛋白分子量約為12 kDa,可以良好的區(qū)分過敏血清及非過敏血清(P0.001),并且能夠明顯抑制全長血藍蛋白與過敏血清之間的反應(yīng),抑制率在26~63%之間,均值為50%,劑量-反應(yīng)曲線呈S型,當(dāng)抑制劑rHc濃度為500μg/ml時,抑制率可達到93%。結(jié)論:1.血藍蛋白是中華絨螯蟹中重要過敏原之一,具有較強的致敏活性;2.生物信息學(xué)預(yù)測的10個候選抗原表位,均為血藍蛋白的抗原表位,預(yù)測結(jié)果較準確;3.采用分子生物學(xué)技術(shù)所制備的關(guān)鍵表位串聯(lián)體,具有良好免疫活性,可以作為蟹過敏體外診斷試劑盒及個體化脫敏治療的候選蛋白。
【關(guān)鍵詞】：食物過敏 中華絨鰲蟹 血藍蛋白 重組過敏原 線性表位
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R392
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 縮略語/符號說明11-12
• 前言12-15
• 研究現(xiàn)狀、成果12-14
• 研究目的、方法14-15
• 一、血藍蛋白是中華絨螯蟹中重要的高分子量過敏原15-30
• 1.1 材料與方法15-21
• 1.1.1 儀器設(shè)備與實驗器材15
• 1.1.2 材料與試劑15-16
• 1.1.3 試劑配制16-17
• 1.1.4 實驗方法17-21
• 1.2 結(jié)果21-26
• 1.2.1 中華絨螯蟹蛋白組分分析21-22
• 1.2.2 中華絨螯蟹致敏組分分析22-24
• 1.2.3 MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜技術(shù)鑒定疑似過敏原組分24-26
• 1.2.4 血藍蛋白反應(yīng)頻率分析26
• 1.3 討論26-29
• 1.4 小結(jié)29-30
• 二、血藍蛋白表位解析及其重組蛋白的表達與鑒定30-61
• 2.1 材料與方法30-47
• 2.1.1 儀器設(shè)備與實驗器材30-31
• 2.1.2 材料與試劑31-32
• 2.1.3 試劑配制32-33
• 2.1.4 實驗方法33-47
• 2.2 結(jié)果47-56
• 2.2.1 血藍蛋白全長重組蛋白Hc的表達及鑒定47-49
• 2.2.2 血藍蛋白線性表位鑒定及關(guān)鍵抗原表位篩選49-52
• 2.2.3 血藍蛋白關(guān)鍵抗原表位重組體rHc的表達及鑒定52-53
• 2.2.4 重組蛋白的免疫學(xué)活性鑒定53-56
• 2.3 討論56-60
• 2.4 小結(jié)60-61
• 結(jié)論61-62
• 參考文獻62-68
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明68-69
• 附錄 169-72
• 綜述 常見食物過敏sIgE分子診斷的研究進展72-86
• 綜述參考文獻80-86
• 致謝86-87
• 個人簡歷87

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1 章躍陵;邢立剛;嚴芳;黃錫望;杜志恒;喬杰;林仲e，

本文編號：855395