發(fā)布時間：2017-09-15 04:21

  本文關鍵詞：腸炎沙門菌sopE2與sptP基因缺失株的構建及其免疫生物學研究

  更多相關文章： 腸炎沙門菌 sptP基因 同源重組 免疫生物學特性

【摘要】：腸炎沙門菌(Salmonella enterica serovar Enteritidis, S. Enteritidis, SE)是革蘭陰性兼性胞內(nèi)寄生菌,主要寄生在人和動物的腸道中,能引起畜禽及人類的沙門菌病,具有重要的公共衛(wèi)生意義。疫苗接種是目前控制人和動物沙門菌病的有效措施之一。由SPI-1和SPI-2編碼的Ⅲ型分泌系統(tǒng)(type III secretion/translocation system, T3SS)是沙門菌致病的重要毒力因子,近年來通過基因工程技術,將病原菌相關毒力基因敲除,構建沙門菌減毒活疫苗的研究備受關注。但是,目前以T3SS SPI-1編碼的效應蛋白基因sopE2和sptP作為沙門菌減毒的靶基因研究還未見報道。本研究分別將腸炎沙門菌C50336株SPI-1 T3SS毒力相關基因敲除,構建了基因缺失株C50336ΔsopE2和C50336ΔsptP,對其生物學特性進行了鑒定,并且對缺失株C50336Asp/P的免疫生物學特性做了評價。一、腸炎沙門菌sopE2與sptP基因缺失株的構建及其生物學特性鑒定利用分子生物學技術構建了重組原核表達質(zhì)粒pET30a-SopE2, pET32a-SptP,導入大腸桿菌E.coli BL21(DE3),通過IPTG誘導,成功表達了重組蛋白rHis-SopE2、rHis-SptP, SDS-PAGE顯示重組蛋白均以可溶性的形式表達,以純化后的兩種重組蛋白分別制備了多克隆抗體。利用λ-Red同源重組系統(tǒng)對腸炎沙門菌sopE2與sptP基因進行敲除,成功構建了腸炎沙門菌缺失株C50336△sopE2和C50336△sptP,并通過重組質(zhì)粒PBR322成功構建回復株C50336△sopE2::sopE2和C50336△sptP::sptP。Real time-PCR與Western blotting分析結(jié)果均表明基因缺失與回復成功。對兩株缺失株的生長、生化特性以及對小鼠的毒力鑒定。結(jié)果表明,兩缺失株生長和生化特性與野生株無顯著差異：C50336AsopE2對小鼠的LD50與野生株相比沒有顯著變化,而C50336△sptP比野生株的LDso至少升高100倍,這為后期研究其作為減毒腸炎沙門菌活疫苗的可能性奠定了重要基礎。二、腸炎沙門菌C50336△sptP的免疫生物學特性研究以鼠源巨噬細胞RAW264.7和人源結(jié)腸癌上皮細胞Caco-2為細胞模型,比較缺失株C50336AsptP與野生株C50336的黏附、侵襲和增殖能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與野生株相比,該缺失株對RAW264.7細胞的侵襲和早期增殖能力均顯著下降(p0.05)；同時,缺失株對Caco-2上皮細胞的侵襲能力也顯著弱于野生株(p0.05)。為評價C50336AsptP減毒后的安全性,以劑量為1×107 CFU和1×108 CFUC50336 AsptP分別免疫小鼠,連續(xù)觀察21天,測定其在小鼠肝臟、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)(mLN)、盲腸及糞便內(nèi)的定植情況。研究發(fā)現(xiàn)在免疫后的21天,1×107CFU免疫組小鼠各臟器中的細菌均已基本被清除；1×108CFU免疫組僅有1只小鼠肝臟、脾臟、mLN中仍攜帶有少量細菌。所有免疫后的小鼠從第3天開始直至21天盲腸與糞便中均已無細菌的定植。同時,從免疫后小鼠體重增長的監(jiān)測結(jié)果顯來看,缺失株的免疫對小鼠體重的增長沒有顯著影響。為進一步測定缺失株在小鼠體內(nèi)引起的免疫應答規(guī)律,以劑量為1×107CFU和1×108CFUC50336△sptP分別對小鼠進行免疫并在兩周后二免,對照組用PBS以相同方式進行免疫,檢測血清IgG抗體和亞型分泌水平以及淋巴細胞的增殖效果。結(jié)果顯示缺失株免疫后能誘導小鼠產(chǎn)生良好的體液免疫應答和細胞免疫應答。以野生株C50336對二免后兩周的小鼠進行攻毒,以評價C50336AsptP對小鼠的免疫保護。結(jié)果顯示強毒株攻毒后1×108 CFU免疫組的免疫保護率為100%,1×107CFU免疫組的免疫保護效率為62.5%,而對照組僅為25%。同時,通過對攻毒后存活小鼠的肝臟、脾臟及盲腸中細菌分離情況發(fā)現(xiàn)免疫組大部分小鼠體內(nèi)已基本不帶菌,而對照組的小鼠體內(nèi)仍攜帶大量細菌。這說明免疫了C50336AsptP后能有助于小鼠對強毒株的清除。
【關鍵詞】：腸炎沙門菌 sptP基因 同源重組 免疫生物學特性
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.61;R378
【目錄】：

• 中文摘要2-4
• Abstract4-8
• 符號說明8-9
• 綜述 沙門菌T3SS相關致病機制及其防治研究進展9-21
• 1 沙門菌9-10
• 1.1 沙門菌病原學與流行病學9
• 1.2 沙門菌的傳播途徑9-10
• 2 T3SS相關效應蛋白在沙門菌感染各階段的功能10-14
• 2.1 依賴SPI-1 T3SS的侵襲過程10-11
• 2.2 沙門菌效應蛋白介導SCV的形成11-12
• 2.3 沙門菌效應蛋白誘導的腸道炎癥反應與細胞調(diào)亡12-14
• 3 沙門菌病的防治14-16
• 3.1 特異性的免疫預防14-16
• 3.2 檢疫凈化措施16
• 4 結(jié)語16-17
• 參考文獻17-21
• 第一章 腸炎沙門菌sopE2與sptP基因缺失株的構建及其生物學特性鑒定21-43
• 1 材料21-23
• 1.1 菌株和質(zhì)粒21-22
• 1.2 主要試劑22
• 1.3 主要儀器22
• 1.4 實驗動物與細胞22-23
• 1.5 引物設計23
• 2 方法23-33
• 2.1 腸炎沙門菌效應蛋白的原核表達23-26
• 2.2 腸炎沙門菌基因缺失株的構建26-28
• 2.3 回復株的構建28
• 2.4 缺失株與回復株對應基因表達情況檢測28-30
• 2.5 腸炎沙門菌缺失株生物學特性鑒定30-32
• 2.6 統(tǒng)計學分析32-33
• 3 結(jié)果33-40
• 3.1 腸炎沙門菌SopE2與SptP蛋白原核表達及鑒定33-35
• 3.2 腸炎沙門菌缺失株及回復株的構建與鑒定35-37
• 3.3 腸炎沙門菌缺失株目的基因和蛋白的體外情況測定37-38
• 3.4 腸炎沙門菌缺失株生物學特性鑒定38-40
• 4 討論40-41
• 參考文獻41-43
• 第二章 腸炎沙門菌C50336△sptP的免疫生物學特性研究43-57
• 1 材料43-44
• 1.1 實驗動物與細胞系43
• 1.2 主要試劑43-44
• 2 方法44-47
• 2.1 腸炎沙門菌sptP缺失株對細胞的感染實驗44-45
• 2.2 C50336△sptP對小鼠的安全性實驗45
• 2.3 C50336△sptP對小鼠的免疫應答規(guī)律測定45-47
• 2.4 免疫保護效力試驗47
• 3 結(jié)果47-52
• 3.1 腸炎沙門菌sptP缺失株對細胞的感染實驗47-49
• 3.2 C50336sptP對小鼠的安全性實驗結(jié)果49-50
• 3.3 C50336△sptP對小鼠免疫應答規(guī)律的測定結(jié)果50-51
• 3.4 免疫保護效力測定結(jié)果51-52
• 4 討論52-55
• 參考文獻55-57
• 致謝57-58
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表論文目錄58-59

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本文編號：854281