本文關(guān)鍵詞：甲型副傷寒沙門菌減毒活疫苗的構(gòu)建及其效能研究

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【摘要】：甲型副傷寒沙門菌(Salmonella paratyphi A,SPA)是甲型副傷寒(paratyphoid fever A)的病原菌,主要通過(guò)糞-口途徑傳播,感染劑量約為103~109CFU/人,能夠引起類似傷寒樣的臨床癥狀。人群對(duì)甲型副傷寒沙門菌普遍易感,但以兒童和青壯年發(fā)病率最高。近年來(lái),由甲型副傷寒沙門菌引起的腸熱癥發(fā)病率在全球很多地區(qū)呈上升趨勢(shì),已經(jīng)成為一個(gè)重大公共衛(wèi)生問(wèn)題。在我國(guó),甲型副傷寒的發(fā)病率較世界其他國(guó)家和地區(qū)更高,并在局部地區(qū)時(shí)有暴發(fā)流行。早期使用的傷寒多價(jià)滅活疫苗雖然對(duì)甲型副傷寒有預(yù)防作用,但因副反應(yīng)大而不再使用,市場(chǎng)上尚無(wú)新的有效預(yù)防甲型副傷寒的疫苗。鑒于甲型副傷寒疫苗的公共衛(wèi)生需求越來(lái)越大,目前有必要盡快開展新的疫苗研發(fā)工作。疫苗主要包括組分疫苗(滅活疫苗類似于組分疫苗)和減毒活疫苗兩大類。組分疫苗由病原體的主要保護(hù)性抗原制備而成,包括蛋白類和多糖類抗原。易感人群通過(guò)接種一定量的抗原誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)該種抗原的抗體,從而對(duì)表達(dá)相關(guān)抗原的病原產(chǎn)生免疫防護(hù),如傷寒沙門菌的Vi多糖疫苗,百白破三聯(lián)疫苗等;減毒活疫苗則是通過(guò)對(duì)病原菌進(jìn)行遺傳改造,使其在毒力大幅度降低、安全性有保障的基礎(chǔ)上保留良好免疫原性,如Ty21a減毒活疫苗、麻疹減毒活疫苗和甲型肝炎減毒活疫苗等。理想的減毒活疫苗是安全性與免疫原性的最佳平衡狀態(tài)。兩類疫苗均能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的系統(tǒng)免疫,從而及時(shí)清除入侵機(jī)體的病原。減毒活疫苗還能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生局部免疫,能夠有效阻止病原菌在局部的定植、增殖和感染,減少隱性感染的發(fā)生幾率,對(duì)疾病的傳播有更好的阻斷作用。甲型副傷寒通常被歸類為"旅行相關(guān)性疾病",其感染后可以形成帶菌狀態(tài),增加了旅行者傳播的危險(xiǎn)。因此,甲型副傷寒減毒活疫苗的構(gòu)建和應(yīng)用更有利于機(jī)體對(duì)甲型副傷寒沙門菌感染的防護(hù),從而控制疾病的流行。我們擬通過(guò)敲除甲型副傷寒沙門菌CMCC50093株的yncD基因和aroC基因構(gòu)建一個(gè)減毒疫苗株。yncD基因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)室前期篩選到的一個(gè)傷寒沙門菌體內(nèi)誘導(dǎo)基因,研究發(fā)現(xiàn),yncD基因敲除后,傷寒沙門菌毒力顯著減弱,且敲除株具有良好的免疫保護(hù)效果。在已測(cè)序的沙門菌4種主要血清型基因組中,yncD基因序列相似度在98%以上,提示yncD基因的功能在沙門菌中高度保守。aroC基因是沙門菌合成芳香族氨基酸的調(diào)控基因,敲除后會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)氨基酸無(wú)法合成,因此導(dǎo)致細(xì)菌在機(jī)體中的生長(zhǎng)繁殖受到限制,進(jìn)而導(dǎo)致毒力的減弱。aroc基因也是一個(gè)構(gòu)建減毒株常用的靶基因。本研究中我們成功構(gòu)建了一個(gè)△yncd/△aroc雙基因敲除的甲型副傷寒沙門菌減毒疫苗株。在評(píng)價(jià)其減毒效果的基礎(chǔ)上,對(duì)疫苗株的遺傳穩(wěn)定性、疫苗的免疫原性和安全性進(jìn)行了初步評(píng)價(jià),主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:1.甲型副傷寒沙門菌野生株的鑒定和表型分析:甲型副傷寒沙門菌cmcc50093株購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所菌種保存中心,在本研究中作為野生株。為進(jìn)一步了解野生株的生物學(xué)性狀,我們首先以ctab法提取其基因組dna,擴(kuò)增16srrna基因并進(jìn)行核酸測(cè)序分析,鑒定野生株。同時(shí)將培養(yǎng)菌株送我校某附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科進(jìn)行生化鑒定及耐藥譜分析。結(jié)果顯示,該株菌為甲型副傷寒沙門菌,生物學(xué)性狀典型,對(duì)常用的針對(duì)革蘭陰性菌的抗生素敏感,適合用于構(gòu)建減毒活疫苗。2.甲型副傷寒沙門菌△yncd/△aroc雙敲除株的構(gòu)建:雙基因敲除株構(gòu)建采用同源重組法進(jìn)行。選用的載體為一個(gè)適用于革蘭陰性菌的自殺性敲除載體pyg4,該載體包含一個(gè)來(lái)源于r6k質(zhì)粒的π蛋白依賴性復(fù)制起點(diǎn)orir6k,使質(zhì)粒只能在表達(dá)π蛋白的菌株中復(fù)制,如e.coils17-1/λpir細(xì)菌,在其它細(xì)菌(包括沙門菌)體內(nèi)則是自殺性的。pyg4質(zhì)粒的正向選擇標(biāo)記為卡那霉素,反向選擇標(biāo)記為sacb基因,后者為來(lái)自于枯草芽胞桿菌的果聚糖蔗糖轉(zhuǎn)移酶基因,表達(dá)該蛋白的革蘭陰性菌在含有蔗糖的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí),會(huì)將蔗糖分解為對(duì)細(xì)菌有毒的產(chǎn)物,從而殺死表達(dá)該蛋白的細(xì)菌,因此可以用于反向選擇。由于采用的是無(wú)痕敲除方式,即敲除目的基因后,突變株基因組中不會(huì)引入任何核酸片段,因此針對(duì)同一菌株可以反復(fù)操作,以實(shí)現(xiàn)多基因的敲除。在本課題研究中,我們兩次采用該自殺載體對(duì)甲型副傷寒沙門菌進(jìn)行目的基因的精確敲除。我們成功獲得了甲型副傷寒沙門菌的△yncd單基因及△yncd/△aroc雙基因敲除株,核苷酸測(cè)序分析表明,在敲除的靶基因處沒(méi)有任何外源片段(包括抗性片段)插入。3.甲型副傷寒沙門菌△yncd/△aroc雙敲除株的生長(zhǎng)曲線和ld50測(cè)定采用三線法將野生株、△yncd單敲除株和△yncd/△aroc雙敲除株接種到同一塊普通的lb平板,觀察△yncd/△aroc雙敲除株菌落生長(zhǎng)狀況;用普通的lb液體培養(yǎng)基測(cè)定其生長(zhǎng)曲線,利用balb/c小鼠腹腔胃黏蛋白增毒模型檢測(cè)△yncd/△aroc雙敲除株的毒力變有無(wú)化。菌落生長(zhǎng)狀況和生長(zhǎng)曲線結(jié)果均顯示,雙敲除株的生長(zhǎng)狀況有了明顯改變,主要表現(xiàn)在生長(zhǎng)速率和最大菌液濃度都較野生株有了顯著的降低;毒力實(shí)驗(yàn)中野生株和雙敲除株分別以2.5×101,2.5×102,2.5×103,2.5×104,2.5×105,2.5×106和2.5×107cfu/只等7個(gè)接種劑量經(jīng)腹腔感染小鼠,3天后計(jì)數(shù)小鼠的存活情況,并用spss軟件的probit回歸分析分別計(jì)算野生株和雙敲除株的半數(shù)致死量(ld50)。結(jié)果顯示雙敲除株的毒力僅為野生株的約1/42000,表明雙敲除株的毒力較野生株有了顯著下降。4.甲型副傷寒沙門菌△yncd/△aroc雙敲除株安全性的初步評(píng)價(jià)利用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)△yncd/△aroc雙敲除株對(duì)單核巨噬細(xì)胞的侵入和胞內(nèi)生存能力,用小鼠腹腔感染模型檢測(cè)感染小鼠的帶菌情況。雙敲除株、△yncd單敲除株和野生株細(xì)菌分別以5×106cfu/孔感染經(jīng)pma誘導(dǎo)后的人單核巨噬細(xì)胞thp1,12小時(shí)后裂解細(xì)胞釋放出細(xì)菌,并用普通lb平板培養(yǎng)后對(duì)菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示,雙敲除株的菌落數(shù)量無(wú)論是最初的侵入數(shù)量還是在胞內(nèi)培養(yǎng)后的數(shù)量都較野生株有顯著地降低,同時(shí)還發(fā)現(xiàn),雙敲除株的菌落數(shù)量隨著胞內(nèi)培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著減少,而野生株正好相反。雙敲除株和野生株細(xì)菌分別以2.5×103,2.5×104,2.5×105cfu/只的接種劑量經(jīng)腹腔注射感染小鼠,接種后第7天處死小鼠,無(wú)菌取出肝、脾臟器,以pbs洗滌后勻漿,勻漿液梯度稀釋后涂布lb平板,對(duì)生長(zhǎng)的菌落計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示,雙敲除株在感染動(dòng)物體內(nèi)的生存能力也有了顯著性的降低,具體表現(xiàn)在野生株在2.5×104和2.5×105cfu劑量下,野生株攻擊組小鼠的臟器中有細(xì)菌存在,而雙敲除株攻擊組則在三個(gè)濃度均沒(méi)有細(xì)菌菌落生長(zhǎng)。以上實(shí)驗(yàn)初步顯示,雙敲除株的侵入能力和胞內(nèi)生存能力都有了顯著降低,安全性較好。5.甲型副傷寒沙門菌△yncd/△aroc雙敲除株的免疫方式和免疫原性評(píng)價(jià)分別采用鼻黏膜接種、腹腔接種和灌胃接種三種方式對(duì)小鼠進(jìn)行免疫,以測(cè)定不同的接種方式對(duì)雙敲除株免疫原性的影響;利用elisa方法檢測(cè)免疫小鼠血清抗-lps抗體滴度初步評(píng)價(jià)雙敲除株的免疫原性。結(jié)果顯示,灌胃接種組未引起小鼠的免疫反應(yīng),而鼻黏膜高濃度(2.0×109cfu/只)接種組和兩個(gè)腹腔接種組均能夠引起小鼠較好的免疫反應(yīng)。以提純的傷寒沙門菌和甲型副傷寒沙門菌lps分別包被96孔板對(duì)小鼠血清中的抗-lps抗體滴度進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示,免疫接種后小鼠血清中的抗體滴度明顯高于未接種小鼠,并且兩種lps的抗體滴度相差不大。沙門菌lps被認(rèn)為是沙門菌主要保護(hù)性抗原之一,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,雙敲除株具有良好的免疫原性。6.甲型副傷寒沙門菌△yncd/△aroc雙敲除株的免疫保護(hù)性評(píng)價(jià)免疫小鼠血清中針對(duì)傷寒沙門菌和甲型副傷寒沙門菌的lps的抗體滴度接近,表明小鼠可能存在針對(duì)傷寒沙門菌的交叉免疫。采用甲型副傷寒沙門菌野生株和傷寒沙門菌Ty2菌株分別對(duì)免疫接種后的小鼠進(jìn)行毒力攻擊,以檢測(cè)雙敲除株的免疫保護(hù)作用和交叉免疫保護(hù)效果。我們采用鼻黏膜高濃度(2.0×109 CFU/只)接種對(duì)小鼠進(jìn)行免疫,同時(shí)設(shè)置PBS對(duì)照。野生株和Ty2株攻擊均采用2.5×101,2.5×102,2.5×103,2.5×104,2.5×105,2.5×106CFU/只6個(gè)劑量。結(jié)果顯示,免疫后的小鼠和對(duì)照小鼠相比較,對(duì)甲型副傷寒沙門菌有很好的免疫防護(hù)作用,而針對(duì)Ty2卻只在低劑量(2.5×101 CFU)時(shí)才和對(duì)照組顯示出明顯的差異,其是否能起到交叉保護(hù)效果尚待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)論證。采用ELISA方法檢測(cè)免疫小鼠在受到毒株攻擊時(shí),血清中IL-6、IL-12和TNF-a等炎癥因子的變化。野生株致死劑量對(duì)免疫小鼠和對(duì)照小鼠進(jìn)行腹腔接種,接種后的20小時(shí)內(nèi)每4小時(shí)取血一次,并檢測(cè)血清中的炎癥因子。結(jié)果顯示,免疫組和對(duì)照組的炎癥因子都有上升,但免疫小鼠上升幅度顯著低于對(duì)照小鼠,同時(shí)消退時(shí)間縮短,表明雙敲除株的免疫能增強(qiáng)細(xì)菌的清除,進(jìn)而減低宿主的炎癥反應(yīng),具有良好的保護(hù)作用。
【關(guān)鍵詞】：甲型副傷寒沙門菌 減毒活疫苗 yncD基因 aroC基因 交叉免疫
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 英文縮寫4-6
• 英文摘要6-10
• 中文摘要10-14
• 第一章 前言14-16
• 第二章 甲型副傷寒沙門菌△ync D/△aro C雙敲除株的構(gòu)建16-44
• 2.1 材料與方法17-33
• 2.2 結(jié)果33-41
• 2.3 討論41-44
• 第三章 甲型副傷寒沙門菌△ync D/△aro C雙敲除株的初步效能研究44-64
• 3.1 材料與方法44-56
• 3.2 結(jié)果56-62
• 3.3 討論62-64
• 全文小結(jié)64-65
• 參考文獻(xiàn)65-70
• 文獻(xiàn)綜述 甲型副傷寒及其病原體研究進(jìn)展70-87
• 參考文獻(xiàn)78-87
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果及參與的課題87-88
• 致謝88

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1 楊e，

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