本文關(guān)鍵詞：食蟹猴TRIM5alpha基因敲低的初步研究

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【摘要】：艾滋病(Acquired Immune Deficiency Syndrome,AIDS)是人類重大疾病,雖然國(guó)內(nèi)外已開(kāi)展了大量的探索性研究,至今未見(jiàn)有效的防治手段,其主要原因之一是缺少能夠感染HIV(Human immunodeficiency virus)致病的動(dòng)物疾病模型。目前諸多研究發(fā)現(xiàn)TRIM5alpha(Tripartite motif protein 5 alpha)是抑制HIV感染的限制因子,能抑制多種逆轉(zhuǎn)錄病毒,它是重要的抗病毒因子。TRIM5α包含了RING結(jié)構(gòu)域、B-Box結(jié)構(gòu)域、Coiled-coil結(jié)構(gòu)域和SPRY(B32.0)結(jié)構(gòu)域。HIV包膜和宿主細(xì)胞膜融合之后,衣殼和TRIM5α蛋白多聚體特異性的結(jié)合,TRIM5α發(fā)揮泛素連接酶的活性,干擾了病毒脫衣殼的有序過(guò)程,從而達(dá)到抑制病毒的目的。TRIM5α在細(xì)胞內(nèi)主要以三聚體的形式存在,胞質(zhì)內(nèi)的TRIM5α蛋白具有實(shí)質(zhì)抑制HIV-1的能力。食蟹猴TRIM5α比人類TRIM5α有更強(qiáng)的抑制HIV-1逆轉(zhuǎn)錄的效力。本研究試圖通過(guò)敲低食蟹猴TRIM5α基因,建立有可能感染HIV的動(dòng)物模型及探究TRIM5α的重要功能�；诖�,本研究針對(duì)食蟹猴TRIM5α基因,利用RNAi(Ribose nucleic acid interfere)技術(shù)合成了相應(yīng)的shRNA(Short hairpin RNA),構(gòu)建了含有相應(yīng)shRNA序列的3個(gè)shRNA質(zhì)粒,分別命名為shRNA1質(zhì)粒、shRNA2質(zhì)粒和shRNA3質(zhì)粒。將表達(dá)質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,制作出相應(yīng)的慢病毒載體。將得到的慢病毒分別感染食蟹猴胚胎成纖維細(xì)胞(Cynomolgus monkey embryo fibroblast,CMEF),被感染的細(xì)胞通過(guò)流式細(xì)胞儀分選得到穩(wěn)定表達(dá)的CMEF細(xì)胞系,分別命名為NTC(Negative Temperature Coefficient)-CMEF、shRNA1-CMEF、shRNA2-CMEF和shRNA3-CMEF細(xì)胞。通過(guò)qRT-PCR分別檢測(cè)TRIM5α基因的表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)NTC-CMEF細(xì)胞內(nèi)TRIM5α基因水平是野生型CMEF表達(dá)水平的97%,shRNA1-CMEF、shRNA2和shRNA3細(xì)胞內(nèi)的TRIM5α基因水平分別是野生型CMEF的52%,43%和39%。通過(guò)Western blot檢測(cè)TRIM5α的蛋白表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)NTC-CMEF細(xì)胞內(nèi)TRIM5α蛋白表達(dá)水平是野生型CMEF表達(dá)水平的108%,shRNA1-CMEF、shRNA2-CMEF和shRNA3-CMEF細(xì)胞內(nèi)的TRIM5α蛋白基因水平分別是野生型CMEF的59%,47%和49%。在驗(yàn)證TRIM5α敲低對(duì)HIV病毒感染方面,利用表達(dá)RFP的假HIV病毒,分別對(duì)NTC-CMEF、shRNA1-CMEF、shRNA2-CMEF和shRNA3-CMEF細(xì)胞進(jìn)行再次感染實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明TRIM5α基因敲低后的食蟹猴細(xì)胞系相對(duì)野生型細(xì)胞可以抑制假HIV-1病毒的感染能力。在食蟹猴胚胎上初步驗(yàn)證了shRNA3慢病毒載體的感染能力。綜上所述,本研究成功獲得了在細(xì)胞水平上得到驗(yàn)證的食蟹猴TRIM5α基因敲低的慢病毒載體,并在食蟹猴胚胎上進(jìn)行了初步研究。本論文研究為建立艾滋病疾病動(dòng)物模型提供了重要的思路和依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：HIV-1 TRIM5α 基因敲低 食蟹猴
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R512.91;R-332
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstracts5-11
• 第1章 前言11-22
• 1.1 艾滋病和HIV11-14
• 1.1.1 HIV分類和起源11
• 1.1.2 HIV-1 進(jìn)化11-12
• 1.1.3 艾滋病的治療12-13
• 1.1.4 中國(guó)艾滋病疫情現(xiàn)狀13-14
• 1.2 艾滋病動(dòng)物感染模型14-17
• 1.2.1 鼠疫缺陷鼠模型14
• 1.2.2 貓和兔感染模型14-15
• 1.2.3 馬感染模型15
• 1.2.4 黑猩猩與食蟹猴模型15-16
• 1.2.5 SHIV動(dòng)物感染模型16-17
• 1.3 天然免疫分子TRIM5α17-21
• 1.3.1 TRIM5α 分子的來(lái)源17
• 1.3.2 TRIM5α 與TRIM蛋白家族17-19
• 1.3.3 TRIM5α 限制HIV復(fù)制的機(jī)制19-21
• 1.3.4 TRIM5α 基因敲低21
• 1.4 慢病毒載體21-22
• 第2章 材料方法22-37
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料22-23
• 2.1.1 細(xì)胞株、質(zhì)粒、菌株22
• 2.1.2 主要試劑和溶液22-23
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備23
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法23-37
• 2.2.1 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)方法23-24
• 2.2.2 表達(dá)單個(gè)shRNA重組慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建24-26
• 2.2.3 慢病毒的包裝26-27
• 2.2.4 重組慢病毒感染CMEF細(xì)胞及細(xì)胞系篩選27-28
• 2.2.5 TRIM5α 基因敲低對(duì)mRNA表達(dá)的影響28-29
• 2.2.6 Western Blot29-32
• 2.2.7 功能驗(yàn)證32
• 2.2.8 胚胎操作32-37
• 第3章 結(jié)果與分析37-50
• 3.1 shRNA重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建37-39
• 3.2 shRNA重組慢病毒包裝39-40
• 3.3 流式分選得到TRIM5α 基因敲低的細(xì)胞系40-42
• 3.4 QRT-PCR結(jié)果42-46
• 3.5 Western Blot結(jié)果46-47
• 3.6 功能驗(yàn)證結(jié)果47-48
• 3.7 激光共聚焦觀察食蟹猴胚胎結(jié)果48-49
• 3.8 小結(jié)49-50
• 第4章 討論與結(jié)論50-54
• 4.1 RNA干擾的應(yīng)用50-51
• 4.2 慢病毒載體的優(yōu)勢(shì)與不足51-52
• 4.3 用HIV-1 假病毒來(lái)進(jìn)行功能分析的討論52
• 4.4 結(jié)論52-54
• 致謝54-56
• 參考文獻(xiàn)56-60

【參考文獻(xiàn)】

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