本文關鍵詞：金黃色葡萄球菌氨基糖苷類、喹諾酮耐藥基因的研究

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【摘要】：目的:金黃色葡萄球菌[Staphylococcus aureus(SA)]是人類化膿感染中最常見的病原菌,可引起局部化膿感染,也可引起肺炎及敗血癥、膿毒癥等全身感染。金黃色葡萄球菌是院內感染的常見細菌之一,許多國家都設有專門機構,應對金葡菌的院內感染問題。隨著內酰胺類抗生素的廣泛應用,耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)隨之增加,且引起的感染和病死率有逐年增加的趨勢。MRSA可通過接觸途徑進行傳播,即易感人群從攜帶者或感染者身上獲得MRSA,導致傳播流行。腺苷酰轉移酶是一種跨膜多重藥物外排蛋白,介導了葡萄球菌對氨基糖苷類藥物(主要是親水性氨基糖苷類藥物)及多種結構上近似甚至無關的藥物耐藥。該菌對多種廣譜抗菌藥物耐藥,給臨床治療帶來很大困難。因此,對其耐藥機制、耐藥基因的傳播與轉移的研究具重要的臨床意義。本研究首次對臨床分離SA氨基糖苷類耐藥基因adenylyltransferase gene、氟喹諾酮耐藥基因Nor A進行克隆、測序、表達及初步功能研究,為進行Adenylyltransfe rase、Nor A蛋白高級結構測定的結晶試驗提供必須材料,同時對耐藥基因的深入功能研究奠定基礎,為從分子水平開展醫(yī)院SA耐藥株感染的控制和監(jiān)測提供依據。方法:取SA臨床分離株復蘇、鑒定。采用離心柱型DNA抽提純化試劑盒提取SA染色體DNA,根據Genbank公布的SA基因序列設計特異性引物,以染色體DNA為模板,通過PCR技術擴增adenylyltransferase、Nor A全基因,PCR產物純化后與p GEX-4t-1載體連接,連接產物轉化大腸桿菌E.coli DH5α,挑取經氨芐篩選的陽性菌落提取質粒并經雙酶切及測序鑒定。轉化大腸桿菌E.coli BL21,經雙酶切鑒定后以異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導重組菌表達,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及免疫印跡法(Western blot)分析表達結果;并對p GEX-4T-1-adenylyltransferase/BL21重組株進行氨基糖苷類類藥敏實驗。另收集臨床分離的22株金黃色葡萄球菌,采用PCR法檢測adenylyltransferase、Nor A基因的攜帶率。結果:復蘇的細菌經再鑒定確定為SA,以SA染色體DNA為模板,PCR擴增出兩個大小分別約783bp、1167bp左右的片段并將其成功克隆入T載體。序列比對分析顯示adenylyltransferase開放閱讀框長783bp,編碼29.9k Da蛋白;NORA開放閱讀框長1167bp,編碼43.9k Da蛋白。成功構建高效表達載體p GEX-4T-1-adenylyltransferase/NORA,經IPTG誘導分別獲得分子量約55k Da、69k Da的融合表達蛋白,與預期分子量相符。重組體大腸桿菌藥敏結果顯示,p GEX-4T-1-NORA/BL21的MIC與p GEX-4T-1/BL21相比僅CIP有2級濃度差異,其余結果一樣。22株金黃色葡萄球菌中檢出腺苷酰轉移酶耐藥基因9株,檢出率為40%;NORA基因12株,檢出率為45%。結論:成功構建了金黃色葡萄球菌氨基糖苷類耐藥基因adenylyltransferase、耐氟喹諾酮耐藥基因Nor A的T載體及高效原核表達載體p GEX-4T-1-adenylyltransferase/Nor A/并獲得2個重組蛋白的大量表達;重組體大腸桿菌藥敏結果顯示,p GEX-4T-1-NORA/BL21的MIC與p GEX-4T-1/BL21相比僅CIP有2級濃度差異,其余結果一樣。22株臨床分離金黃色葡萄球菌攜帶adenylyltransferase、NORA基因的比率分別為45%、40%。
【關鍵詞】：金黃色葡萄球菌 腺苷酰轉移酶耐藥基因 多重耐藥轉運蛋白基因 克隆 表達
【學位授予單位】：廣東藥學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R378
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-9
• 前言9-14
• 第一章 金黃色葡萄球菌腺苷酰轉移酶耐藥基因與氨基糖苷類耐藥的相關性研究14-33
• 1.1 實驗材料14-16
• 1.2 實驗方法16-25
• 1.3 結果25-31
• 1.3.1 SA的培養(yǎng)及鑒定25
• 1.3.2 染色體 DNA 的提取及 SA 腺苷酰轉移酶耐藥基因的 PCR 結果25-26
• 1.3.3 p GEX-4T-1-adenylyltransferase 重組質粒的雙酶切結果26-27
• 1.3.4 p GEX-4T-1-adenylyltransferase 重組質粒的測序結果27-28
• 1.3.5 p GEX-4T-1-adenylyltransferase 重組質粒的鑒定28-29
• 1.3.6 SDS-PAGE 檢測重組蛋白的表達29
• 1.3.7 Western blot 檢測 GST-adenylyltransferase 融合蛋白29-31
• 1.3.8 腺苷酰轉移酶耐藥基因檢測結果31
• 1.4 討論31-32
• 1.5 小結32-33
• 第二章 金黃色葡萄球菌氟喹諾酮NORA耐藥基因的克隆與表達33-51
• 2.1 材料與方法34-37
• 2.2 實驗方法37-42
• 2.3 結果42-49
• 2.3.1 SA NORA基因的PCR結果42
• 2.3.2 p GEX-4T-1-NORA 重組質粒的雙酶切結果42-43
• 2.3.3 p GEX-4T-1-NORA 重組質粒的測序結果43-44
• 2.3.4 p GEX-4T-1-NORA 重組質粒的鑒定44-45
• 2.3.5 SDS-PAGE 檢測重組蛋白的表達45
• 2.3.6 Western blot 檢測重組融合蛋白45-47
• 2.3.7 NORA 基因檢測結果47
• 2.3.8 E-test 檢測重組體的藥敏結果47
• 2.3.9 SA130903014 對常用抗菌藥的耐藥性47-48
• 2.3.10 SA 對氟喹諾酮類藥物的耐藥性與 NORA 耐藥基因的關系48-49
• 2.4 討論49-50
• 2.5 小結50-51
• 第三章 廣州地區(qū)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染的臨床分布及耐藥性分析51-57
• 3.1 材料與方法51-52
• 3.2 結果52-54
• 3.3 討論54-56
• 3.4 小結56-57
• 結論57-58
• 參考文獻58-62
• 綜述62-69
• 參考文獻67-69
• 附錄： 縮略詞69-70
• 致謝70-71
• 攻讀學位期間發(fā)表的論文71

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據庫 前5條

1 李玉紅,鄒全明;氨基糖苷類鈍化酶耐藥機制的研究進展[J];國外醫(yī)學.藥學分冊;2005年03期

2 劉倩;許學年;周巖;程娜;董玉婷;鄭華軍;朱永強;馮正;;華支睪吸蟲含串聯(lián)重復序列的Cs22抗原蛋白的克隆及特征分析[J];中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志;2013年04期

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本文編號：688477