發(fā)布時(shí)間：2017-08-17 10:21

  本文關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌氨基糖苷類、喹諾酮耐藥基因的研究

  更多相關(guān)文章： 金黃色葡萄球菌 腺苷酰轉(zhuǎn)移酶耐藥基因 多重耐藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 克隆 表達(dá)

【摘要】：目的:金黃色葡萄球菌[Staphylococcus aureus(SA)]是人類化膿感染中最常見的病原菌,可引起局部化膿感染,也可引起肺炎及敗血癥、膿毒癥等全身感染。金黃色葡萄球菌是院內(nèi)感染的常見細(xì)菌之一,許多國(guó)家都設(shè)有專門機(jī)構(gòu),應(yīng)對(duì)金葡菌的院內(nèi)感染問題。隨著內(nèi)酰胺類抗生素的廣泛應(yīng)用,耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)隨之增加,且引起的感染和病死率有逐年增加的趨勢(shì)。MRSA可通過接觸途徑進(jìn)行傳播,即易感人群從攜帶者或感染者身上獲得MRSA,導(dǎo)致傳播流行。腺苷酰轉(zhuǎn)移酶是一種跨膜多重藥物外排蛋白,介導(dǎo)了葡萄球菌對(duì)氨基糖苷類藥物(主要是親水性氨基糖苷類藥物)及多種結(jié)構(gòu)上近似甚至無關(guān)的藥物耐藥。該菌對(duì)多種廣譜抗菌藥物耐藥,給臨床治療帶來很大困難。因此,對(duì)其耐藥機(jī)制、耐藥基因的傳播與轉(zhuǎn)移的研究具重要的臨床意義。本研究首次對(duì)臨床分離SA氨基糖苷類耐藥基因adenylyltransferase gene、氟喹諾酮耐藥基因Nor A進(jìn)行克隆、測(cè)序、表達(dá)及初步功能研究,為進(jìn)行Adenylyltransfe rase、Nor A蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定的結(jié)晶試驗(yàn)提供必須材料,同時(shí)對(duì)耐藥基因的深入功能研究奠定基礎(chǔ),為從分子水平開展醫(yī)院SA耐藥株感染的控制和監(jiān)測(cè)提供依據(jù)。方法:取SA臨床分離株復(fù)蘇、鑒定。采用離心柱型DNA抽提純化試劑盒提取SA染色體DNA,根據(jù)Genbank公布的SA基因序列設(shè)計(jì)特異性引物,以染色體DNA為模板,通過PCR技術(shù)擴(kuò)增adenylyltransferase、Nor A全基因,PCR產(chǎn)物純化后與p GEX-4t-1載體連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli DH5α,挑取經(jīng)氨芐篩選的陽(yáng)性菌落提取質(zhì)粒并經(jīng)雙酶切及測(cè)序鑒定。轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli BL21,經(jīng)雙酶切鑒定后以異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)重組菌表達(dá),十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及免疫印跡法(Western blot)分析表達(dá)結(jié)果;并對(duì)p GEX-4T-1-adenylyltransferase/BL21重組株進(jìn)行氨基糖苷類類藥敏實(shí)驗(yàn)。另收集臨床分離的22株金黃色葡萄球菌,采用PCR法檢測(cè)adenylyltransferase、Nor A基因的攜帶率。結(jié)果:復(fù)蘇的細(xì)菌經(jīng)再鑒定確定為SA,以SA染色體DNA為模板,PCR擴(kuò)增出兩個(gè)大小分別約783bp、1167bp左右的片段并將其成功克隆入T載體。序列比對(duì)分析顯示adenylyltransferase開放閱讀框長(zhǎng)783bp,編碼29.9k Da蛋白;NORA開放閱讀框長(zhǎng)1167bp,編碼43.9k Da蛋白。成功構(gòu)建高效表達(dá)載體p GEX-4T-1-adenylyltransferase/NORA,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)分別獲得分子量約55k Da、69k Da的融合表達(dá)蛋白,與預(yù)期分子量相符。重組體大腸桿菌藥敏結(jié)果顯示,p GEX-4T-1-NORA/BL21的MIC與p GEX-4T-1/BL21相比僅CIP有2級(jí)濃度差異,其余結(jié)果一樣。22株金黃色葡萄球菌中檢出腺苷酰轉(zhuǎn)移酶耐藥基因9株,檢出率為40%;NORA基因12株,檢出率為45%。結(jié)論:成功構(gòu)建了金黃色葡萄球菌氨基糖苷類耐藥基因adenylyltransferase、耐氟喹諾酮耐藥基因Nor A的T載體及高效原核表達(dá)載體p GEX-4T-1-adenylyltransferase/Nor A/并獲得2個(gè)重組蛋白的大量表達(dá);重組體大腸桿菌藥敏結(jié)果顯示,p GEX-4T-1-NORA/BL21的MIC與p GEX-4T-1/BL21相比僅CIP有2級(jí)濃度差異,其余結(jié)果一樣。22株臨床分離金黃色葡萄球菌攜帶adenylyltransferase、NORA基因的比率分別為45%、40%。
【關(guān)鍵詞】：金黃色葡萄球菌 腺苷酰轉(zhuǎn)移酶耐藥基因 多重耐藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 克隆 表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：廣東藥學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R378
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-9
• 前言9-14
• 第一章 金黃色葡萄球菌腺苷酰轉(zhuǎn)移酶耐藥基因與氨基糖苷類耐藥的相關(guān)性研究14-33
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料14-16
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法16-25
• 1.3 結(jié)果25-31
• 1.3.1 SA的培養(yǎng)及鑒定25
• 1.3.2 染色體 DNA 的提取及 SA 腺苷酰轉(zhuǎn)移酶耐藥基因的 PCR 結(jié)果25-26
• 1.3.3 p GEX-4T-1-adenylyltransferase 重組質(zhì)粒的雙酶切結(jié)果26-27
• 1.3.4 p GEX-4T-1-adenylyltransferase 重組質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果27-28
• 1.3.5 p GEX-4T-1-adenylyltransferase 重組質(zhì)粒的鑒定28-29
• 1.3.6 SDS-PAGE 檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)29
• 1.3.7 Western blot 檢測(cè) GST-adenylyltransferase 融合蛋白29-31
• 1.3.8 腺苷酰轉(zhuǎn)移酶耐藥基因檢測(cè)結(jié)果31
• 1.4 討論31-32
• 1.5 小結(jié)32-33
• 第二章 金黃色葡萄球菌氟喹諾酮NORA耐藥基因的克隆與表達(dá)33-51
• 2.1 材料與方法34-37
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法37-42
• 2.3 結(jié)果42-49
• 2.3.1 SA NORA基因的PCR結(jié)果42
• 2.3.2 p GEX-4T-1-NORA 重組質(zhì)粒的雙酶切結(jié)果42-43
• 2.3.3 p GEX-4T-1-NORA 重組質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果43-44
• 2.3.4 p GEX-4T-1-NORA 重組質(zhì)粒的鑒定44-45
• 2.3.5 SDS-PAGE 檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)45
• 2.3.6 Western blot 檢測(cè)重組融合蛋白45-47
• 2.3.7 NORA 基因檢測(cè)結(jié)果47
• 2.3.8 E-test 檢測(cè)重組體的藥敏結(jié)果47
• 2.3.9 SA130903014 對(duì)常用抗菌藥的耐藥性47-48
• 2.3.10 SA 對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥性與 NORA 耐藥基因的關(guān)系48-49
• 2.4 討論49-50
• 2.5 小結(jié)50-51
• 第三章 廣州地區(qū)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染的臨床分布及耐藥性分析51-57
• 3.1 材料與方法51-52
• 3.2 結(jié)果52-54
• 3.3 討論54-56
• 3.4 小結(jié)56-57
• 結(jié)論57-58
• 參考文獻(xiàn)58-62
• 綜述62-69
• 參考文獻(xiàn)67-69
• 附錄： 縮略詞69-70
• 致謝70-71
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文71

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

1 李玉紅,鄒全明;氨基糖苷類鈍化酶耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).藥學(xué)分冊(cè);2005年03期

2 劉倩;許學(xué)年;周巖;程娜;董玉婷;鄭華軍;朱永強(qiáng);馮正;;華支睪吸蟲含串聯(lián)重復(fù)序列的Cs22抗原蛋白的克隆及特征分析[J];中國(guó)寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志;2013年04期

3 高s，

本文編號(hào)：688477