本文關(guān)鍵詞：KNDC1過表達(dá)對人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老的作用及其機(jī)制研究

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【摘要】：背景和目的：衰老是機(jī)體隨著年齡的增長,其機(jī)體生理功能逐漸下降的過程,是發(fā)病率日益增長的年齡相關(guān)性疾病,如老年癡呆、心血管疾病的獨立危險因素。這些疾病大多與血管功能老化有關(guān),而隨著老齡人口的不斷增加,正日益成為社會和家庭的沉重負(fù)擔(dān)。目前控制血管功能老化已經(jīng)成為控制年齡相關(guān)性疾病的重要環(huán)節(jié)。血管老化最初被定義為血管脆性增加,舒縮能力降低。事實上血管功能紊亂是上述疾病共同的發(fā)病基礎(chǔ),早衰病的患者大多數(shù)都合并有動脈粥樣硬化疾病。值得注意的是,多個和衰老有關(guān)的基因已經(jīng)被證實和血管功能障礙有關(guān),如FOXO1A、FOXO3A、sirt-1等。這說明血管衰老、機(jī)體老化及年齡相關(guān)性疾病之間存在本質(zhì)的聯(lián)系。血管作為運輸通道,為組織提供營養(yǎng)、氧氣及生物活性物質(zhì),并且?guī)ё呓M織產(chǎn)生的廢物和二氧化碳。動脈血管是由內(nèi)膜、中膜及外膜構(gòu)成,其中動脈內(nèi)膜是橫亙在血流和血管之間的薄層組織,由內(nèi)皮細(xì)胞及基膜構(gòu)成。內(nèi)皮細(xì)胞不僅在胚胎組織血管生成過程中起重要作用,而且在諸如損傷修復(fù)、缺血適應(yīng)、腫瘤生成等過程中同樣發(fā)揮重要作用。除此之外,內(nèi)皮細(xì)胞可以感知血流變化,并且通過產(chǎn)生血管活性物質(zhì)如一氧化氮(NO)、血管緊張Ⅱ,調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞。因此,內(nèi)皮細(xì)胞在維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用。生理狀態(tài)下,內(nèi)皮細(xì)胞在體內(nèi)幾乎處于靜止?fàn)顟B(tài),生理狀態(tài)下只有約0.1%的內(nèi)皮細(xì)胞保持增殖狀態(tài)。然而,當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞暴露于病理刺激后,可以被激活并進(jìn)入分裂狀態(tài),最終將引起端粒縮短,細(xì)胞進(jìn)入衰老期后,內(nèi)皮細(xì)胞呈現(xiàn)出衰老相關(guān)的形態(tài)和功能改變,細(xì)胞變得扁平,體積增大,細(xì)胞多倍體數(shù)目增加。除此之外,內(nèi)皮細(xì)胞還出現(xiàn)β半乳糖苷酶活性增強(qiáng)、細(xì)胞停滯在細(xì)胞周期的GO/GI期、衰老相關(guān)的蛋白表達(dá)陽性等；同時,血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老過程中,分泌的各種生物學(xué)活性因子也在發(fā)生變化,如NO的合成下降、炎性因子合成增加、粘附因子表達(dá)增多等。這些變化都將造成內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙,最終導(dǎo)致動脈粥樣硬化的發(fā)生。目前研究表明氧化應(yīng)激是導(dǎo)致細(xì)胞衰老的經(jīng)典機(jī)制之一,ROS可導(dǎo)致DNA嚴(yán)重?fù)p傷,細(xì)胞基因表達(dá)的變化,繼而細(xì)胞進(jìn)入不可逆的凋亡和衰老過程中。p53/p21是一種重要的細(xì)胞衰老相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。此外,P53可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平,p53對ROS的調(diào)控主要依賴于p53對其下游氧化還原相關(guān)靶基因的調(diào)控。KNDC1 (kinase non-catalytic C-lobe domain (KIND) containing 1,KNDC1)位于人類染色體10q263位點,是2006年新發(fā)現(xiàn)的基因,其功能與Ras鳥苷酸交換因子活性(Ras guanyl-nucleotide exchange factor activity)和蛋白絲/蘇氨酸激酶活性(protein serine/threonine kinase activity)相關(guān)。目前哺乳動物中發(fā)現(xiàn)4種含有KIND域的蛋白：Spir2、PTPN13 (nonreceptor-type protein tyrosine phosphatase 13)、 FRMPD2 (FERM and PDZ-domain-containing 2)和KNDC1。KNDC1存在于樹突、鳥苷酸交換因子復(fù)合物、以及神經(jīng)元細(xì)胞體中,參與了大腦顆粒細(xì)胞分化,具有蛋白磷酸酶活性,并具有調(diào)節(jié)催化活性。在許多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的蛋白間分子識別和功能調(diào)控中扮演著重要角色。既往研究表明KNDC1的RasGEF舌性通過JNK1和／或ERK,經(jīng)由Ras-Raf-MAP激酶通路誘導(dǎo)MAP2的磷酸化,MAP2磷酸化后與微管結(jié)合的活性增加,可以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞樹突的長度增加,研究還發(fā)現(xiàn)抑制或敲低KNDC1的表達(dá)可以促進(jìn)培養(yǎng)中的小腦顆粒細(xì)胞和海馬神經(jīng)元的樹突生長,這表明其作為一種信號分子在發(fā)育過程中調(diào)控或者抑制神經(jīng)元樹突生長。但是其對血管內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)節(jié)功能及作用機(jī)制國內(nèi)外尚未見研究報道。我們既往的研究已經(jīng)證明了KNDC1 mRNA轉(zhuǎn)錄及KNDC1蛋白表達(dá)在衰老的HUVECs有所增加。而且通過敲低KNDC1的表達(dá)后,內(nèi)皮細(xì)胞的衰老得以延遲。然而,尚需要更多的研究證實KNDC1在內(nèi)皮細(xì)胞衰老中的作用和機(jī)制。因此本研究將通過內(nèi)皮細(xì)胞KNDC1過表達(dá)方法,確認(rèn)其在內(nèi)皮細(xì)胞衰老中的作用,并進(jìn)一步對其作用機(jī)制進(jìn)行探討。方法：1.細(xì)胞培養(yǎng)：實驗所用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞由新生兒臍帶分離獲得,臍帶由北京某三甲醫(yī)院產(chǎn)科提供,細(xì)胞分離后,加入含20%胎牛血清的ECM培養(yǎng)液,放入5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)中37℃培養(yǎng)。首次獲得的細(xì)胞為第0代,第一次傳代后獲得的細(xì)胞為第一代。培養(yǎng)液2-3天更換一次,當(dāng)細(xì)胞增殖到80-90%融合度時,使用0.125%胰蛋白酶進(jìn)行1：3傳代。根據(jù)我們前期實驗結(jié)果,選擇第6-10代的細(xì)胞進(jìn)行實驗,并培養(yǎng)在六孔板中。2.腺病毒轉(zhuǎn)染：KNDC1腺病毒交由Santa Cruz Biotechnology公司合成。選擇第6代內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染KNDC1腺病毒,同時設(shè)置空白對照組及陰性對照組(空白腺病毒),并培養(yǎng)24小時。分組情況為：(1)C,空白對照組；(2)A,陰性對照組,轉(zhuǎn)染空白腺病毒；(3)K30/60/90,實驗組,分別轉(zhuǎn)染劑量為30/60/90 epu/cell的KNDC1腺病毒。3.mRNA表達(dá)分析：內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)上述處理后,用TRIZOI試劑提取每組細(xì)胞總RNA,使用SYBR PrimeScript RT-PCR試劑盒,通過qPCR檢測內(nèi)皮細(xì)胞的KNDC1的mRNA的表達(dá)。在檢測過程中以GAPDH作為內(nèi)對照。并且以GAPDH為內(nèi)參,使用CT值計量mRNA相對表達(dá)量。CT值的含義是：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。因此每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)存在負(fù)性關(guān)系,即起始拷貝數(shù)越多,CT值越小。使用Sequence Detector System software version 2.1進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,CT值自動轉(zhuǎn)化為RNA的倍數(shù)變化值,計算方式為(實驗組與對照組)倍數(shù)變化=2-(△△CT),where一(△△CT)=-(△CTtrt-△CTcontrol)=-[(CtTarget-CtGAPDH)trt-(CtTarget—CtGAPDH)control].4.β-半乳糖苷酶染色：內(nèi)皮細(xì)胞被轉(zhuǎn)染不同濃度的KNDCl月泉病毒后培養(yǎng)48小時,吸除細(xì)胞培養(yǎng)基,并以PBS沖洗細(xì)胞面兩遍,使用固定液室溫固定15min。吸除細(xì)胞固定液,用PBS洗滌細(xì)胞3次。加入染色工作液,37℃孵育24小時。普通光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照：胞漿呈藍(lán)色者為陽性細(xì)胞,表示細(xì)胞處于衰老狀態(tài),計算出的陽性細(xì)胞總數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分率,實驗重復(fù)3次。5.Westemblot檢測衰老相關(guān)蛋白：采用Westemblot法檢測人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞KNDC1、SIRT1、p53.p-p53、Erk、p-Erk、p21、p27、eNOS蛋白的表達(dá)。6.抗氧化酶活性檢測：分光光度法檢測各組臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中超氧化物歧化酶(SOD)活性和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)含量。7.統(tǒng)計學(xué)分析：所有實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean士SD)表示。兩組間比較采用t檢驗；三組比較采用單因素方差分析比較,如差別存在統(tǒng)計學(xué)意義,采用SNK方法進(jìn)行組間兩兩比較。P0.05,認(rèn)為具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果：1.在本研究中,第六代的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞已經(jīng)呈現(xiàn)出有別于前期傳代細(xì)胞的衰老特征,細(xì)胞變得扁平,體積增大,增殖能力降低。為了進(jìn)一步研究KNDC1是否與細(xì)胞衰老有關(guān),通過qPCR及western blot的方法,我們檢測了各代齡細(xì)胞間KNDC1轉(zhuǎn)錄水平和表達(dá)水平的變化,發(fā)現(xiàn)隨著臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的衰老,KNDC1轉(zhuǎn)錄水平和表達(dá)水平逐漸增加,并且具有統(tǒng)計學(xué)差異。2.使用攜帶KNDC1的腺病毒轉(zhuǎn)染第六代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后,KNDC1的表達(dá)水平顯著上升。KNDC1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平增加了239-344%,同樣的KNDC1蛋白質(zhì)表達(dá)也顯著增加,并且有明顯的劑量依賴性。3.和對照組相比,轉(zhuǎn)染KNDC1腺病毒后的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞SA-β-Gal染色陽性率顯著上升。隨著KNDC1腺病毒轉(zhuǎn)染劑量從30至90 epu/cell,內(nèi)皮細(xì)胞SA-β-gal染色陽性率也大致呈劑量依賴性增加,各組間染色陽性率分別為6.2±1.3%(C),8.2±0.3%(A),26.3±2.5%(K30),62.9±2.8%(K60)和55.3±5.8%(K90)。K60和K90兩組染色陽性率無明顯差異,因此在以后的研究中實驗組KNDC1腺病毒轉(zhuǎn)染量均為60 epu/cell。4.為了探究KNDC1高表達(dá)是否影響內(nèi)皮細(xì)胞MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,我們檢測各組細(xì)胞間MAPK相關(guān)蛋白的表達(dá),發(fā)現(xiàn)磷酸化erk表達(dá)量明顯下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。5.作為一種重要的細(xì)胞周期抑制因子,實驗組磷酸化p53較陰性對照組明顯增加(113.5±9.0 vs.244.3±19.5),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,提示p53信號通路在KNDC1相關(guān)性細(xì)胞衰老中發(fā)揮了重要作用。6.本課題組既往研究表明]SNDC1敲低可以通過減少細(xì)胞內(nèi)活性氧含量而延緩細(xì)胞衰老,在本研究中,我們確認(rèn)了這種變化,實驗組抗氧化酶含量較對照組下降(SOD:98.0±3.0 vs.83.3±5.1 and Gpx:95.0±6.0 vs.83.0±5.6),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：1.本實驗成功的構(gòu)建了攜帶KNDC1基因的重組腺病毒載體,并運用重組腺病毒載體成功轉(zhuǎn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,且轉(zhuǎn)染率較高。2.KNDC1腺病毒轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞后β半乳糖苷酶染色陽性,證明KNDC1在內(nèi)皮細(xì)胞衰老途徑中發(fā)揮了重要作用。3.KNDC1腺病毒轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞后抗氧化酶表達(dá)降低,證實了氧化應(yīng)激與KNDC1相關(guān)性內(nèi)皮細(xì)胞衰老形成有著直接的聯(lián)系。4. KNDC1可以激活p53/p21信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞衰老。并且p53和ROS間可能存在一個反饋環(huán)。較強(qiáng)或持續(xù)壓力刺激下p53發(fā)揮促氧化作用,而ROS的過量產(chǎn)生又可進(jìn)一步激活p53,從而形成p53-ROS正反饋環(huán),這一正反饋環(huán)在推動衰老發(fā)生的過程中發(fā)揮重要作用。通過實驗結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)KNDC1調(diào)控這一正反饋環(huán)而影響細(xì)胞早衰。5. KNDC1可通過MAPK途徑,抑制erk的磷酸化,抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖,從而間接發(fā)揮致衰老的作用。
【關(guān)鍵詞】：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 衰老 KNDC1 p53 Erk 氧化應(yīng)激
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R339.38
【目錄】：

• 摘要4-9
• ABSTRACT9-18
• 前言18-22
• 材料與方法22-36
• 2.1 主要試劑及配制22-23
• 2.2 主要儀器23-24
• 2.3 HUVECs培養(yǎng)24-28
• 2.4 腺病毒轉(zhuǎn)染28
• 2.5 SA-β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色28-29
• 2.6 RT-PCR29-31
• 2.7 western blot31-34
• 2.8 細(xì)胞抗氧化指標(biāo)(SOD、GPx活性)的測定34-35
• 2.9 統(tǒng)計分析35-36
• 結(jié)果36-45
• 3.1 內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定36-37
• 3.2 KNDC1高表達(dá)對內(nèi)皮細(xì)胞衰老的影響及機(jī)制37-45
• 討論45-53
• 4.1 內(nèi)皮細(xì)胞的分離鑒定45-46
• 4.2 KNDC1高表達(dá)對內(nèi)皮細(xì)胞衰老的影響及機(jī)制46-53
• 結(jié)論53-54
• 參考文獻(xiàn)54-59
• 附錄59-61
• 英文縮略詞表59-60
• 發(fā)表文章60
• 參與的科研項目60-61
• 致謝61-62

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本文編號：679857