本文關(guān)鍵詞：唑來膦酸對破骨細(xì)胞分化中鈣離子振蕩和CaMKⅡ、CaMKⅣ、NFATc1基因表達(dá)的影響

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【摘要】：目的利用RANKL誘導(dǎo)小鼠白血病單核巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株構(gòu)建體外破骨細(xì)胞培養(yǎng)體系,研究唑來膦酸對體外破骨細(xì)胞分化成熟過程中鈣離子振蕩和鈣離子下游關(guān)鍵信號分子CaMKII、CaMKIV、NFATc1基因表達(dá)的影響,從分子水平探討唑來膦酸對破骨細(xì)胞分化和骨吸收功能抑制的作用,進(jìn)而進(jìn)一步揭示唑來膦酸對破骨細(xì)胞抑制作用的機(jī)理。方法1建立RAW264.7細(xì)胞體外培養(yǎng)體系,首先探討不同濃度的唑來膦酸對細(xì)胞增殖的影響。將細(xì)胞分為7組:A組,為對照組;B組~G組,分別用1×10-7mol/L、1×10-6mol/L、5×10-6mol/L、1×10-5mol/L、5×10-5mol/L和1×10-4mol/L濃度的唑來膦酸處理細(xì)胞。除A組外,其他各組用ZOL作用5d,然后應(yīng)用倒置相差顯微鏡對細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察,并應(yīng)用噻唑藍(lán)(MTT)實驗檢測RAW264.7細(xì)胞增殖情況。2將RAW264.7細(xì)胞分為對照組和唑來膦酸(ZOL)處理組,以探討唑來膦酸對破骨細(xì)胞生成、Ca2+振蕩、CaMKII、CaMKIV、NFATc1基因表達(dá)的影響。兩組細(xì)胞均用RANKL誘導(dǎo)5d,而ZOL組在RANKL誘導(dǎo)1d后,加用1×10-6mol/L的唑來膦酸處理2d。細(xì)胞收獲后,進(jìn)行如下檢測:(1)應(yīng)用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色及牙本質(zhì)磨片吸收陷窩檢測評價兩組細(xì)胞破骨細(xì)胞生成及骨吸收情況;(2)鈣離子振蕩檢測:兩組細(xì)胞在1×10-6mol/L的ZOL處理后0h、1h、3h、6h、12h、24h、48h和72h(ZOL去除后24h)、96h(ZOL去除后48h),在激光共聚焦顯微鏡下應(yīng)用熒光染料Fluo-4、Fluo-red檢測破骨細(xì)胞分化過程中鈣離子振蕩情況,評價唑來膦酸對破骨細(xì)胞分化過程中鈣離子振蕩的影響。(3)兩組細(xì)胞應(yīng)用RANKL誘導(dǎo)5d后,收獲細(xì)胞,分別應(yīng)用Real-time PCR、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)、western-blot技術(shù)檢測兩組細(xì)胞CaMKII、CaMKIV、NFATc1基因表達(dá)情況。結(jié)果1唑來膦酸濃度為(1×10-7mol/L、1×10-6mol/L、5×10-6mol/L)時對RAW264.7細(xì)胞的增殖不產(chǎn)生影響,沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而濃度為1×10-5mol/L時對RAW264.7細(xì)胞的增殖有輕微的抑制作用,但細(xì)胞形態(tài)及大小沒有明顯變化,而濃度為5×10-5mol/L、1×10-4mol/L對RAW264.7細(xì)胞增殖受到明顯抑制,細(xì)胞數(shù)目明顯下降,部分細(xì)胞體積變小,部分細(xì)胞發(fā)生崩解,呈碎屑狀(P0.01)。2經(jīng)RANKL誘導(dǎo)及唑來膦酸處理后,對照組和唑來膦酸(ZOL)處理組檢測結(jié)果如下:(1)TRAP染色及牙本質(zhì)磨片吸收陷窩檢測顯示,兩組細(xì)胞都有TRAP+多核破骨細(xì)胞形成(胞核≥3個)和有骨吸收陷窩出現(xiàn),但是唑來膦酸處理組破骨細(xì)胞數(shù)目、牙本質(zhì)磨片吸收陷窩的數(shù)目和面積分別為33.0±1.0,46.0±3.5和4125.9±674.8μm2,顯著低于對照組的66.6±3.2,86.0±9.2和9418.3±1260.8μm2(P0.05或P0.01)。(2)唑來膦酸對鈣離子振蕩的影響具有時間依賴性:1×10-6mol/L的唑來膦酸在作用初期(0~3h),對鈣離子振蕩沒有明顯的抑制作用;而隨著作用時間的延長(6~48h),唑來膦酸對鈣離子振蕩產(chǎn)生了明顯的抑制作用,且隨著時間的延長抑制作用越來越明顯;在唑來膦酸撤除后(72~96h),鈣離子振蕩逐漸恢復(fù),上升到與對照相似的水平。(3)Real-time PCR檢測顯示,唑來膦酸處理組CaMKII、CaMKIV、NFATc1 mRNA水平較對照組均顯著降低,分別下降了39.3%和51.7%和54.7%(P0.01)。(4)Western-blot檢測顯示,唑來膦酸處理組CaMKII、CaMKIV、NFATc1的蛋白表達(dá)水平較對照組顯著降低,蛋白條帶灰度值分別下降了58.9%、46.8%和39.8%(P0.05)。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測也顯示,唑來膦酸處理組CaMKII、CaMKIV、NFATc1蛋白熒光強(qiáng)度均顯著低于對照組(P0.05)。結(jié)論研究結(jié)果提示,唑來膦酸鹽可顯著抑制破骨細(xì)胞生成及胞內(nèi)鈣離子振蕩,并下調(diào)CaMKII、CaMKIV、NFATc1基因表達(dá);鈣信號分子CaMKII、CaMKIV、NFATc1可能參與了唑來膦酸對破骨細(xì)胞分化的抑制,并在其中發(fā)揮極其重要的作用。
【關(guān)鍵詞】：唑來膦酸 破骨細(xì)胞 鈣離子振蕩 鈣調(diào)蛋白依賴性激酶II 鈣調(diào)蛋白依賴性激酶IV 活化T細(xì)胞核因子c1
【學(xué)位授予單位】：華北理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 引言11-13
• 第1章 實驗研究13-47
• 1.1 材料13-15
• 1.1.1 試劑和藥物13-14
• 1.1.2 儀器和設(shè)備14-15
• 1.2 實驗方法15-25
• 1.2.1 RAW264.7 細(xì)胞的培養(yǎng)15
• 1.2.2 不同濃度唑來膦酸對RAW264.7 細(xì)胞增殖的影響15-16
• 1.2.3 唑來膦酸對破骨細(xì)胞生成和功能的影響16-18
• 1.2.4 唑來膦酸對破骨細(xì)胞分化中鈣離子波動的影響18-19
• 1.2.5 唑來膦酸對破骨細(xì)胞分化中信號分子CaMKII、CaMKIV、NFATc1基因表達(dá)的影響19-25
• 1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析25
• 1.3 結(jié)果25-38
• 1.3.1 唑來膦酸對RAW264.7 細(xì)胞增殖的影響25-28
• 1.3.2 唑來膦酸對破骨細(xì)胞生成和功能的影響28-29
• 1.3.3 唑來膦酸對破骨細(xì)胞分化中鈣離子振蕩（Ca_(2+) oscillation）的影響29-32
• 1.3.4 唑來膦酸對破骨細(xì)胞分化過程中CaMKII、CaMKIV、NFATc1表達(dá)的影響32-38
• 1.4 討論38-42
• 1.4.1 破骨細(xì)胞與唑來膦酸38-40
• 1.4.2 鈣離子振蕩在唑來膦酸抑制OC分化和功能的作用40-41
• 1.4.3 CaMKII/IV在唑來膦酸抑制OC分化和功能的作用41-42
• 1.4.4 NFATc1在唑來膦酸抑制OC分化和功能的作用42
• 1.5 小結(jié)42-43
• 參考文獻(xiàn)43-47
• 第2章 綜述 鈣離子信號通路在破骨細(xì)胞分化過程中的相關(guān)研究背景47-56
• 2.1 Ca_(2+)- NFATc1信號通路在破骨細(xì)胞中的作用47
• 2.2 NFATc1在破骨細(xì)胞中的作用47-48
• 2.2.1 NFATc1的結(jié)構(gòu)47
• 2.2.2 NFATc1的作用機(jī)制47-48
• 2.3 鈣離子振蕩在破骨細(xì)胞中的作用48-49
• 2.3.1 鈣離子在破骨細(xì)胞中的作用和鈣離子的誘發(fā)因素48-49
• 2.3.2 鈣離子在破骨細(xì)胞中的作用機(jī)制49
• 2.4 CaMKs在破骨細(xì)胞中的作用49-52
• 2.4.1 CaMKs對破骨細(xì)胞的作用和分類49-50
• 2.4.2 CaMKII的生物學(xué)特性50
• 2.4.3 CaMKII在破骨細(xì)胞分化中的作用及機(jī)制50-51
• 2.4.4 CaMKIV的生物學(xué)特性51-52
• 2.4.5 CaMKIV在破骨細(xì)胞分化中的作用及機(jī)制52
• 2.5 總結(jié)與展望：52
• 參考文獻(xiàn)52-56
• 結(jié)論56-57
• 致謝57-58
• 導(dǎo)師簡介58-59
• 作者簡介59-60
• 學(xué)位論文數(shù)據(jù)集60

【共引文獻(xiàn)】

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