本文關(guān)鍵詞：利用轉(zhuǎn)基因小鼠篩選全人源炭疽致死因子中和抗體

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【摘要】：炭疽是由炭疽芽孢桿菌引起的嚴(yán)重威脅人類健康的傳染病,在世界范圍內(nèi)具有廣泛的分布。我國傳染病防治法將其列為乙類傳染病。依據(jù)感染途徑不同,炭疽可分為皮膚炭疽、胃腸炭疽和肺炭疽三種類型。肺炭疽致死率高達(dá)90%以上,我國將其按甲類傳染病進(jìn)行預(yù)防和控制。炭疽芽孢桿菌的致病因子由三種毒素蛋白和一種聚-D-谷氨酰莢膜組成,其中三種毒素蛋白是致病的主要因素,這三種蛋白是:保護(hù)性抗原(protective antigen,PA)、水腫因子(edema factor,EF)和致死因子(lethal factor,LF)。三種蛋白單獨存在不具有毒性,當(dāng)PA與EF結(jié)合可形成水腫毒素(edema toxin,ET),PA與LF結(jié)合可形成致死毒素(lethal toxin,LT)。由于LT在感染者損傷及死亡中發(fā)揮主要作用,因此在炭疽感染晚期單純使用抗生素治療難以發(fā)揮療效,治療性中和抗體成為目前最有效的炭疽治療藥物。目前國外獲得的炭疽毒素抗體多為炭疽PA抗體,美國FDA已批準(zhǔn)瑞西巴庫(人源PA單抗)用于吸入性炭疽的治療。一旦炭疽芽孢桿菌被人為改構(gòu)或PA中和表位發(fā)生突變,針對PA單一表位的抗體將可能失效,而針對LF的抗體將成為炭疽治療的有效補充。目前文獻(xiàn)中已報導(dǎo)的LF抗體多為鼠源抗體和嵌合抗體,由于鼠源單抗和嵌合單抗免疫原性高,易引起人抗鼠抗體(human anti-mouse antibody,HAMA)反應(yīng)從而很難應(yīng)用于臨床。全人源單抗避免了鼠源單抗免疫原性高等缺點,具有半衰期長、安全性高等優(yōu)點,因此得到了廣泛的應(yīng)用。隨著單個B細(xì)胞抗體制備技術(shù)的興起,單細(xì)胞PCR技術(shù)被用于體外克隆和表達(dá)單個B細(xì)胞的抗體基因,單細(xì)胞PCR技術(shù)避免了多輪篩選過程,能夠快速高通量獲得抗體基因且保持抗體重、輕鏈天然配對,因此單細(xì)胞PCR技術(shù)將成為獲取人源單抗的最新研究方法之一。由于LF抗原不能直接用于免疫志愿者從而獲得人抗體基因,而轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)可以克服無疫苗免疫或病患血樣等缺點,可用于直接免疫抗原,篩選全人源單克隆抗體。因此可利用轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)與單細(xì)胞PCR技術(shù)相結(jié)合的方法快速獲得全人源抗體基因。鑒于此,本課題將利用轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)、流式分選技術(shù)和單細(xì)胞PCR技術(shù),篩選全人源炭疽致死因子中和抗體。首先,制備炭疽LF毒素蛋白,用于后續(xù)免疫轉(zhuǎn)基因小鼠、體外細(xì)胞毒素中和試驗及體內(nèi)大鼠毒素攻毒研究。通過制備及純化LF抗原,并利用小鼠巨噬細(xì)胞J774A.1對LF的生物學(xué)活性進(jìn)行評價,獲得了純度高、活性好、具有天然序列的LF,為轉(zhuǎn)基因小鼠的免疫和中和抗體水平檢測提供了保證。在對轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行免疫前,首先對其體液免疫特性進(jìn)行了分析。鑒于轉(zhuǎn)基因小鼠與普通小鼠免疫應(yīng)答存在區(qū)別,將三只轉(zhuǎn)基因小鼠作為實驗組,三只普通雄性C57BL/6小鼠作為對照組。在第0、2、4周免疫LF,分別在免疫前及免疫后不同時間點對小鼠尾靜脈采血,ELISA法測定血清中LF抗體滴度。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因小鼠抗體效價整體水平與普通C57BL/6小鼠存在差別,轉(zhuǎn)基因小鼠免疫抗原后抗體效價上升速度比C57BL/6小鼠緩慢;且抗體效價低于C57BL/6小鼠。通過研究轉(zhuǎn)基因小鼠的免疫特點,找到其合適的免疫方式、免疫周期對于篩選全人源單抗至關(guān)重要。將弗氏佐劑與抗原LF按比例混合并在第0、2、4周再次免疫2只轉(zhuǎn)基因小鼠,在免疫前及免疫后7 d、14 d、28 d、42 d尾靜脈采血。ELISA法檢測血清中LF結(jié)合抗體水平,TNA法檢測血清中LF中和抗體水平。由于記憶B細(xì)胞表面存在BCR受體,因此可以通過標(biāo)記LF抗原特異的記憶B細(xì)胞篩選炭疽LF單克隆抗體。根據(jù)前期文獻(xiàn)調(diào)研及實驗得知,小鼠在最后一次免疫后第14天至21天記憶B細(xì)胞數(shù)量相對較多,適合進(jìn)行分選。取最后一次免疫第14天的轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟,經(jīng)研磨獲取脾細(xì)胞懸液,對脾細(xì)胞懸液中特異的記憶B細(xì)胞進(jìn)行熒光染色后,利用流式細(xì)胞儀分選獲得288個記憶B細(xì)胞,經(jīng)單細(xì)胞反轉(zhuǎn)錄PCR和巢式PCR擴增抗體基因,最終獲得了48對重、輕鏈配對的抗體可變區(qū)基因,單細(xì)胞PCR的陽性率約為17%。通過重疊延伸PCR,構(gòu)建由啟動子、前導(dǎo)序列、抗體全長基因、多聚A尾(poly(A)tail)組成的線性表達(dá)框,構(gòu)建48對抗體線性表達(dá)框基因轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。ELISA法對轉(zhuǎn)染上清進(jìn)行結(jié)合活性測定,獲得結(jié)合單抗2株,分別為1D7和2B9。對其基因序列進(jìn)行分析,2株LF單抗均為全人源單抗。構(gòu)建LF單抗表達(dá)質(zhì)粒,瞬時轉(zhuǎn)染Expi 293F細(xì)胞,采用Protein A親和層析柱對細(xì)胞上清進(jìn)行純化,對獲得的2株抗體采用SPR技術(shù)測定其親和力大小,1D7單抗親和力高于2B9單抗。細(xì)胞毒性試驗(TNA)測定2株單抗體外中和活性,兩株LF單抗均對細(xì)胞起到了100%的保護(hù)作用;Fisher 344大鼠模型測定2株單抗體內(nèi)中和活性,兩株LF單抗均能延長大鼠存活時間。最后,本課題也對LF單抗與PA單抗的聯(lián)合使用進(jìn)行了探究,結(jié)果表明2株LF單抗均能與炭疽PA單抗發(fā)揮一定的協(xié)同作用,并且2株LF單抗與無保護(hù)活性的PA單抗8A7聯(lián)合使用時,無論對體外細(xì)胞毒性試驗還是體內(nèi)大鼠攻毒試驗,均可產(chǎn)生良好的保護(hù)效果。綜上所述,本課題通過用LF抗原免疫人抗體轉(zhuǎn)基因小鼠,篩選獲得了抗LF的全人源單抗,同時探索了轉(zhuǎn)基因小鼠的免疫特點以及單抗聯(lián)合使用的效果。本課題的創(chuàng)新點在于利用了轉(zhuǎn)基因小鼠、流式分選技術(shù)和單細(xì)胞PCR技術(shù)相結(jié)合的優(yōu)勢,不僅快速獲得了全人源炭疽LF單克隆抗體,也為快速篩選其他全人源單克隆抗體開辟了新的思路與方法。
【關(guān)鍵詞】：炭疽致死因子 轉(zhuǎn)基因小鼠 流式分選 單細(xì)胞PCR 記憶B細(xì)胞 全人源單克隆抗體
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R392
【目錄】：

• 主要縮略詞表6-8
• 摘要8-11
• Abstract11-14
• 前言14-18
• 第一章 全人源炭疽致死因子單抗的篩選與鑒定18-48
• 第一節(jié) 炭疽毒素致死因子的制備與檢測18-22
• 1. 材料和方法18-19
• 1.1 材料18
• 1.2 方法18-19
• 1.2.1 炭疽毒素LF的誘導(dǎo)表達(dá)及抽提18
• 1.2.2 炭疽毒素LF的純化及純度分析18-19
• 1.2.3 炭疽毒素LF的細(xì)胞毒性試驗19
• 2. 結(jié)果19-21
• 2.1 LF純化效果19-20
• 2.2 LF的細(xì)胞毒性分析20-21
• 3. 討論21-22
• 第二節(jié) 轉(zhuǎn)基因小鼠的免疫及體液免疫特性分析22-27
• 1. 材料和方法22-23
• 1.1 材料22
• 1.2 方法22-23
• 1.2.1 轉(zhuǎn)基因小鼠的免疫及血液采集22
• 1.2.2 血清中LF結(jié)合抗體的ELISA檢測22-23
• 1.2.3 TNA法檢測小鼠血清LF中和抗體水平23
• 2. 結(jié)果23-26
• 2.1 轉(zhuǎn)基因小鼠體液免疫特性分析23-24
• 2.2 血清中LF結(jié)合抗體水平檢測24-25
• 2.3 小鼠血清LF中和抗體水平25-26
• 3. 討論26-27
• 第三節(jié) 流式分選記憶B細(xì)胞獲取LF單抗基因27-36
• 1. 材料和方法27-32
• 1.1 材料27
• 1.2 方法27-32
• 1.2.1 轉(zhuǎn)基因小鼠脾細(xì)胞的分離27-28
• 1.2.2 抗原特異的記憶B細(xì)胞表面抗原的染色28
• 1.2.3 流式細(xì)胞儀分選單個抗原特異的記憶B細(xì)胞28
• 1.2.4 單細(xì)胞反轉(zhuǎn)錄PCR擴增抗體基因28-31
• 1.2.5 單細(xì)胞巢式PCR擴增抗體基因31-32
• 2. 結(jié)果32-34
• 2.1 轉(zhuǎn)基因小鼠脾細(xì)胞的分離32
• 2.2 流式分選單個記憶B細(xì)胞32
• 2.3 LF單抗重、輕鏈基因的獲取32-34
• 2.4 抗體基因序列分析34
• 3. 討論34-36
• 第四節(jié) 全人源LF單克隆抗體的篩選36-48
• 1. 材料和方法36-42
• 1.1 材料36
• 1.2 方法36-42
• 1.2.1 單抗基因線性表達(dá)框的構(gòu)建36-41
• 1.2.2 單抗基因線性表達(dá)框的表達(dá)41
• 1.2.3 ELISA法篩選LF結(jié)合單抗41
• 1.2.4 LF中和單抗的TNA篩選41-42
• 2. 結(jié)果42-46
• 2.1 單抗基因線性表達(dá)框構(gòu)建與表達(dá)42-44
• 2.1.1 線性表達(dá)框各基因片段的擴增42-43
• 2.1.2 重疊延伸PCR構(gòu)建單抗線性表達(dá)框43-44
• 2.2 單抗基因的表達(dá)與LF單抗的鑒定44-46
• 2.2.1 結(jié)合單抗的篩選44-45
• 2.2.2 中和單抗的篩選45
• 2.2.3 LF單抗基因序列比對45-46
• 3. 討論46-48
• 第二章 全人源炭疽LF中和單抗的功能研究48-64
• 第一節(jié) 全人源LF單克隆抗體的中和活性研究48-56
• 1. 材料和方法48-50
• 1.1 材料48
• 1.2 方法48-50
• 1.2.1 LF中和單抗表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、表達(dá)及純化48-49
• 1.2.2 SPR法測定LF單抗親和力49-50
• 1.2.3 TNA法測定LF中和單抗體外中和活性50
• 1.2.4 大鼠攻毒實驗測定LF中和單抗體內(nèi)中和活性：50
• 2. 結(jié)果50-54
• 2.1 獲取LF中和單抗50-52
• 2.1.1 LF單抗全長基因克隆至pc DNA3.4 表達(dá)質(zhì)粒50-51
• 2.1.2 LF單抗的表達(dá)和純化51-52
• 2.2 LF中和單抗的親和力測定52-53
• 2.3 LF中和單抗的體外中和活性測定53
• 2.4 LF中和單抗的體內(nèi)中和活性測定53-54
• 3. 討論54-56
• 第二節(jié) 全人源LF單抗與PA單抗的協(xié)同作用研究56-64
• 1. 材料和方法56-57
• 1.1 材料56
• 1.2 方法56-57
• 1.2.1 LF中和單抗體外協(xié)同作用的TNA測定56-57
• 1.2.2 LF單抗和PA單抗體內(nèi)協(xié)同試驗57
• 1.2.3 單抗協(xié)同作用評價57
• 2 結(jié)果57-62
• 2.1 LF單抗與炭疽PA單抗 2A6的協(xié)同作用分析57-60
• 2.2 LF單抗與炭疽PA單抗 8A7的協(xié)同作用分析60-62
• 3 討論62-64
• 結(jié)論64-66
• 參考文獻(xiàn)66-70
• 附錄 主要溶液配制70-72
• 個人簡歷72-73
• 致謝73

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9 賈永林;賈延R，

本文編號：521720