本文關(guān)鍵詞：弓形蟲CK1α缺失株感染小鼠毒力試驗(yàn)及機(jī)制研究

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【摘要】：弓形蟲,為頂復(fù)動(dòng)物門寄生原蟲,可感染人類和幾乎其他所有的溫血?jiǎng)游?常引起孕婦妊娠階段流產(chǎn),胎兒畸形、先天性缺陷或死胎等嚴(yán)重后果,免疫能力低下人群感染嚴(yán)重疾病。近幾年研究表明,弓形蟲還會(huì)影響宿主的一些行為舉止,甚至與多種精神疾病有關(guān)。據(jù)國外報(bào)道,人感染弓形蟲的平均感染率為25%~50%。而我國的人群感染率在0.1%~47.3%,豬感染率為4.78%~85.7%,牛的感染率為0.2%~43.4%。可見弓形蟲病已經(jīng)嚴(yán)重影響了人類的健康生活和畜牧業(yè)的發(fā)展。蛋白激酶(Protein Kinase,PK)在弓形蟲增殖、分化和感染過程中起著至關(guān)重要的作用。以往研究表明,鈣依賴蛋白激酶Ⅰ(CDPK1)在弓形蟲胞吐中起著重要的調(diào)節(jié)作用;絲裂原活化蛋白激酶Ⅰ(MAPK1)通過誘導(dǎo)一氧化氮復(fù)合物(iNOS)合成抑制干擾素(IFN)合成,調(diào)節(jié)弓形蟲的增殖;棒狀體蛋白激酶是一種弓形蟲特有的蛋白激酶,參與調(diào)控弓形蟲對宿主免疫反應(yīng)的影響。酪蛋白激酶(CK)是真核生物的一種保守的絲/蘇氨酸蛋白激酶,由Bnrnet在1954年在大鼠的肝臟中發(fā)現(xiàn)的,其功能是催化肽鏈中鄰近酸性氨基酸殘基的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化。該蛋白激酶由Ⅰ型酪蛋白激酶(Casein Kinase 1,CK1)和Ⅱ型酪蛋白激酶(Casein Kinase 2,CK2)兩大家族蛋白組成。CK1參與調(diào)節(jié)多種重要的細(xì)胞過程,包括wnt信號(hào)通路、膜運(yùn)輸、細(xì)胞骨架的維護(hù)等。最近研究發(fā)現(xiàn)多種原核生物有CK1基因表達(dá),如弓形蟲、瘧原蟲、利氏曼原蟲、錐蟲等。此外,CK1抑制劑還可以抑制鞭毛蟲和錐蟲在血液中的增殖。CK1在機(jī)體多種生理活動(dòng)中發(fā)揮著舉足輕重的作用,如細(xì)胞分裂與凋亡、DNA修復(fù)、P53調(diào)控、周期性節(jié)律等。弓形蟲基因組可以編碼CK1α和CK1β兩種CK1亞型,其中只有CK1α具有酶活性。CK1α是一種非第二信使依賴的激酶,以ATP作為單一磷酸供體,分布于細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)以及細(xì)胞核中。在哺乳動(dòng)物中,CK1α參與多種細(xì)胞生理活動(dòng),如細(xì)胞周期、染色體分離、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞分化和細(xì)胞凋亡等。此外,CK1α參與Wnt/β-Cat、Hedgehog(Hh)及NF-κB等信號(hào)通路。弓形蟲作為一種重要的模式生物和人獸共患病原,CK1α基因在其感染宿主過程中的作用還不清楚。研究目的:利用實(shí)驗(yàn)室已有的CK1α克隆缺失株(△ck1α)感染BALB/c小鼠,通過與野生株GT1對比,確定CK1α對弓形蟲感染宿主毒力的影響。利用熒光定量PCR、elisa、轉(zhuǎn)錄組測序和westernblot等方法,推論出ck1α調(diào)節(jié)弓形蟲毒力的具體機(jī)制。為預(yù)防弓形蟲感染,研制疫苗和治療藥物提供一定的依據(jù)。研究內(nèi)容:1、通過小鼠攻蟲試驗(yàn),確定ck1α缺失對弓形蟲毒力的影響;2、研究ck1α調(diào)節(jié)弓形蟲毒力的具體機(jī)制。研究方法:1、確定ck1α對弓形蟲毒力的影響90只6~8周齡balb/c雌性小鼠,采用隨機(jī)分組的方法分為9組,每組十只小鼠,每只小鼠腹腔接種200μl弓形蟲速殖子稀釋液。第一組:每只小鼠接種102個(gè)gt1速殖子;第二組:每只小鼠接種103個(gè)gt1速殖子;第三組:每只小鼠接種104個(gè)gt1速殖子;第四組:每只小鼠接種102個(gè)△ck1α速殖子;第五組:每只小鼠接種103個(gè)△ck1α速殖子;第六組:每只小鼠接種104個(gè)△ck1α速殖子;第七組:每只小鼠接種102個(gè)ck1α回補(bǔ)株速殖子;第八組:每只小鼠接種103個(gè)ck1α回補(bǔ)株速殖子;第九組:每只小鼠接種104個(gè)ck1α回補(bǔ)株速殖子;根據(jù)小鼠死亡時(shí)間繪制生存曲線,分析ck1α缺失對于宿主生存時(shí)間的影響。在感染第3天和第7天處死感染小鼠,觀察小鼠肝組織損傷狀況,elisa檢測天冬門氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartateaminotransferase,ast)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alaninetransaminase,alt)含量,定量pcr(rt-pcr)檢測肝臟組織和脾臟組織荷蟲量,流式細(xì)胞術(shù)檢測血清中il-12、ifn-γ等細(xì)胞因子含量,分析ck1α缺失對弓形蟲毒力的影響。2、確定ck1α調(diào)節(jié)弓形蟲毒力的機(jī)制取感染3天和7天小鼠的肝臟組織和脾臟組織,westernblot檢測肝臟組織和脾臟組織中mapk信號(hào)通路、nf-κb信號(hào)通路和stat信號(hào)通路活化情況,熒光定量pcr(rt-pcr)檢測肝臟組織和脾臟組織中il-12、ifn-γ等細(xì)胞因子含量,轉(zhuǎn)錄組測序檢測棒狀體蛋白轉(zhuǎn)錄水平變化。確定ck1α調(diào)節(jié)弓形蟲毒力的具體機(jī)制。研究結(jié)果:1、ck1α缺失后,小鼠生存時(shí)間減短。第三組小鼠在腹腔注射5天后出現(xiàn)明顯的體外特征,在注射7-9天內(nèi)死亡,平均存活時(shí)間(mst)為7.7天。第一組和第二組小鼠在注射后10-13天死亡,mst分別為11.4天和10.4天。第六組小鼠在腹腔注射后4天出現(xiàn)明顯癥狀,在注射6-8天死亡,mst為6.8天。第四組和第五組在注射后8-12天死亡,mst分別為10.5天和8.4天。注射回補(bǔ)株組mst與等量注射gt1速殖子組mst無明顯差異(p0.05)。2、CK1α缺失后,弓形蟲毒力增加�！鱟k1α感染小鼠,肝組織較GT1野生株出現(xiàn)明顯的病理性損傷;天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)含量相較于GT1感染小鼠均提高了4~6倍,而谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)含量提高了2~4倍;肝脾組織荷蟲量均明顯高于GT1感染小鼠;△ck1α感染小鼠血清中IL-12和IFN-γ分泌量低于GT1感染小鼠。3、△ck1α通過ROP16活化STAT3抑制IL-12分泌,增加弓形蟲毒力�！鱟k1α感染小鼠,肝脾組織中MAPK信號(hào)通路蛋白和NF-κB信號(hào)通路蛋白基本無明顯差異,只有肝組織內(nèi)MAPK p38磷酸化程度增加,這可能是導(dǎo)致肝組織嚴(yán)重?fù)p傷的原因。肝脾組織中STAT1/4蛋白磷酸化程度均低于GT1感染小鼠,STAT3/6明顯高于GT1,轉(zhuǎn)錄組測序檢測發(fā)現(xiàn)ROP16蛋白分泌量△ck1α感染小鼠明顯高于GT1。研究結(jié)論:1、△ck1α感染小鼠生存時(shí)間明顯減短,CK1α缺失后,弓形蟲毒力顯著增強(qiáng);2、△ck1α通過分泌過量的ROP16蛋白活化STAT3來抑制IL-12的分泌,增強(qiáng)了弓形蟲的毒力。
【關(guān)鍵詞】：弓形蟲 酪蛋白激酶1α 毒力 信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子 棒狀體蛋白
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.7;R382.5
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• Abstract8-11
• 前言11-12
• 第一章 弓形蟲CK1α缺失株感染小鼠毒力試驗(yàn)12-22
• 1.1 材料13-14
• 1.2 方法14-17
• 1.3 結(jié)果17-20
• 1.4 討論20
• 1.5 小結(jié)20-22
• 第二章 弓形蟲CK1α缺失株毒力增強(qiáng)機(jī)制研究22-33
• 2.1 材料22-24
• 2.2 方法24-28
• 2.3 結(jié)果28-31
• 2.4 討論31-32
• 2.5 小結(jié)32-33
• 結(jié)論33-34
• 參考文獻(xiàn)34-36
• 導(dǎo)師簡介36-37
• 作者簡介37-38
• 致謝38

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