本文關(guān)鍵詞：clpP基因在銅綠假單胞菌毒力中的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:銅綠假單胞菌是一種革蘭陰性條件性致病菌,易在長(zhǎng)期住院患者特別是肺部囊性纖維化病人中引起慢性持續(xù)性感染。感染致病過程中,該菌可表達(dá)多種毒力因子——細(xì)菌表面的毒性因子(菌毛、鞭毛、脂多糖、藻酸鹽等)和細(xì)菌分泌至胞外的毒素(堿性蛋白酶、外毒素A、彈性蛋白酶、磷脂酶、綠膿菌素以及III型分泌系統(tǒng)分泌的效應(yīng)蛋白等),在醫(yī)院感染病原體中居于首位。細(xì)菌的致病能力可受到外界環(huán)境變化的影響,維持菌體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)有助于細(xì)菌毒力因子的完整表達(dá)。研究表明ClpP蛋白酶對(duì)維持細(xì)菌在應(yīng)激條件下的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著重要的作用。ClpP蛋白酶由clpP基因編碼,最初在大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn),與調(diào)節(jié)亞基ClpX或ClpA結(jié)合形成復(fù)合物,后者可識(shí)別未折疊蛋白特定的多肽序列,并將這些蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至ClpP蛋白酶水解成小分子肽,從而降解及清除細(xì)菌在應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生并堆積的不可逆損傷蛋白,維持菌體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。大腸埃希菌和腸桿菌科的ClpP蛋白酶可調(diào)節(jié)Ⅲ型分泌系統(tǒng)及其它毒力因子的表達(dá),影響細(xì)菌致病。而ClpP在銅綠假單胞菌中的作用卻鮮有報(bào)道,由于銅綠假單胞菌的ClpP蛋白酶與大腸埃希菌具有70%的同源性,因此我們推測(cè)銅綠假單胞菌的ClpP蛋白酶與大腸埃希菌ClpP蛋白酶具有相似的生物學(xué)功能,對(duì)該菌毒力因子的表達(dá)也具有一定的調(diào)控作用。為此,本研究擬構(gòu)建銅綠假單胞菌PAO1的clpP基因缺陷株和過表達(dá)菌株,對(duì)III型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白基因的表達(dá)、綠膿菌素產(chǎn)量、運(yùn)動(dòng)能力、生物膜等毒力因子進(jìn)行測(cè)定,初步探討clpP基因在銅綠假單胞菌毒力中的作用。方法:(1)PCR擴(kuò)增clpP基因同源臂與慶大霉素抗性基因(GN)插入自殺質(zhì)粒pEX18-Tc,構(gòu)建clpP基因敲除載體,轉(zhuǎn)化銅綠假單胞菌PAO1,構(gòu)建clpP基因缺陷株ΔclpP。(2)PCR擴(kuò)增clpP基因開放讀碼框(clpP-C),插入pBBR1MCS-2質(zhì)粒lacZ啟動(dòng)子的下游,構(gòu)建clpP基因表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化ΔclpP,構(gòu)建clpP基因過表達(dá)菌株s-clpp。(3)用trizol抽提銅綠假單胞菌的總rna,real-time熒光定量pcr檢測(cè)野生株、clpp基因缺陷株及clpp基因過表達(dá)菌株Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)基因exos、exot和exoy的表達(dá)情況。(4)采用氯仿抽提綠膿菌素,520nm處測(cè)吸光度以檢測(cè)野生株、clpp基因缺陷株和clpp基因過表達(dá)菌株產(chǎn)綠膿菌素量的變化。(5)采用運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)專用培養(yǎng)基檢測(cè)野生株、clpp基因缺陷株和clpp基因過表達(dá)菌株的三種運(yùn)動(dòng)情況(蜂群、泳動(dòng)和蹭行)。(6)體外培養(yǎng)銅綠假單胞菌72h形成生物膜,結(jié)晶紫染色后用熒光相差顯微鏡觀察野生株、clpp基因缺陷株及clpp基因過表達(dá)菌株變化。(7)以生長(zhǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),od600值為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線,觀察野生株、clpp基因缺陷株和clpp基因過表達(dá)菌株的生長(zhǎng)情況。(8)平板生存實(shí)驗(yàn)以lb(ph7.0)平板上生長(zhǎng)的菌落數(shù)為對(duì)照,通過比較生長(zhǎng)于含有一定濃度h2o2、nacl和鹽酸的lb平板上的菌落數(shù),觀察野生株、clpp基因缺陷株及clpp基因過表達(dá)菌株對(duì)h2o2、nacl和酸的耐受能力。結(jié)果:(1)酶切、pcr及測(cè)序結(jié)果表明,clpp基因敲除載體構(gòu)建正確,將其導(dǎo)入野生株后,成功構(gòu)建銅綠假單胞菌clpp基因缺陷株Δclpp,測(cè)序結(jié)果表明,clpp基因37bp~453bp缺失。(2)酶切、pcr及測(cè)序結(jié)果表明,clpp表達(dá)質(zhì)粒pbb-clpp構(gòu)建正確,將其導(dǎo)入Δclpp后,成功構(gòu)建銅綠假單胞菌clpp基因過表達(dá)菌株s-clpp。(3)real-time熒光定量pcr檢測(cè)結(jié)果顯示,Δclpp的t3ss效應(yīng)基因exos、exot和exoy的表達(dá)量較野生株分別下降了32.2%、52.4%和57.7%,而s-clpp的表達(dá)量分別是野生株的4.11倍、7.11倍和4.25倍。(4)clpp基因缺陷株產(chǎn)綠膿菌素的含量約為野生株的一半,而clpp基因過表達(dá)菌株產(chǎn)綠膿菌素的量約為野生株的2.5倍。(5)clpp基因缺陷株三種運(yùn)動(dòng)能力均較野生株減弱,而clpp基因過表達(dá)菌株的三種運(yùn)動(dòng)能力均可恢復(fù)至野生株水平。(6)銅綠假單胞菌在模擬流動(dòng)環(huán)境中培養(yǎng)72h后形成生物膜,與野生株相比,clpP基因缺陷株形成生物膜的能力大為減弱,而clpP基因過表達(dá)菌株形成生物膜的量與野生株相當(dāng)。(7)37℃培養(yǎng)銅綠假單胞菌達(dá)7h并繪制生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn),clpP基因缺陷株在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期生長(zhǎng)速度明顯較野生株緩慢,而進(jìn)入平臺(tái)期后生長(zhǎng)速度相互接近,但是clp P基因過表達(dá)菌株與clpP基因缺陷株的生長(zhǎng)并未有明顯差別。(8)clpP基因缺陷株對(duì)H2O2、NaCl和酸的抵抗能力明顯下降,而clpP基因過表達(dá)菌株抗氧化應(yīng)激能力與野生株相當(dāng)。結(jié)論:clpP基因在銅綠假單胞菌毒力中發(fā)揮著重要作用,參與并調(diào)節(jié)Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)基因的表達(dá)、產(chǎn)綠膿菌素、運(yùn)動(dòng)能力、生物膜形成以及抗氧化應(yīng)激能力。
【關(guān)鍵詞】：銅綠假單胞菌 clpP基因 毒力
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R378.991
【目錄】：

• 中英文縮略詞表4-5
• 中文摘要5-8
• ABSTRACT8-11
• 前言11-14
• 第一部分clp P基因缺陷株及過表達(dá)菌株構(gòu)建14-32
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料14-16
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法16-25
• 3. 結(jié)果25-30
• 4. 討論30-31
• 5. 結(jié)論31-32
• 第二部分clp P基因在銅綠假單胞菌毒力中的作用32-50
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料32-33
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法33-38
• 3. 結(jié)果38-44
• 4. 討論44-49
• 5. 結(jié)論49-50
• 附錄50-54
• 參考文獻(xiàn)54-59
• 致謝59-60
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文60
• 攻讀學(xué)位期間參加學(xué)術(shù)會(huì)議情況60
• 攻讀學(xué)位期間參與科研課題情況60
• 攻讀學(xué)位期間參與編書60-61
• 綜述61-68
• 參考文獻(xiàn)66-68

【共引文獻(xiàn)】

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6 張麗R，

本文編號(hào)：508765