本文關(guān)鍵詞：EV71減毒活疫苗的研發(fā)和減毒機(jī)制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：手足口病(Hand, foot and mouse disease, HFMD)已成為一種全球性廣泛流行的急性傳染病。而腸道病毒71型(Entervrius71, EV71)是引起手足口病的主要病原體之一,其主要感染5歲以下嬰幼兒,會(huì)導(dǎo)致部分患者產(chǎn)生嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)綜合癥甚至死亡。近年來(lái),關(guān)于EV71減毒疫苗及減毒機(jī)制的研究進(jìn)展緩慢,而如何降低EV71活病毒的毒力并對(duì)其毒力減弱情況進(jìn)行評(píng)價(jià)是減毒活疫苗研發(fā)過(guò)程中的亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。本文從多株臨床樣本中分離并篩選出1株感染性滴度較高、乳鼠致死率為100%的EV71毒株,對(duì)其進(jìn)行體內(nèi)傳代和體內(nèi)外交替?zhèn)鞔蟀l(fā)現(xiàn)：體內(nèi)連續(xù)傳5代后,毒株對(duì)乳鼠的致病性并沒(méi)有明顯減弱,但第5代與第2代相比,在細(xì)胞上完全病變的時(shí)間明顯延長(zhǎng),這表示在乳鼠體內(nèi)連續(xù)傳代后病毒在人二倍體細(xì)胞上的適應(yīng)性有所降低；而交替?zhèn)鞔臉悠?傳至第4代,其對(duì)乳鼠的致病性有一定減弱的趨勢(shì)。通過(guò)對(duì)FY23-K毒株進(jìn)行體外不同溫度和方式傳代發(fā)現(xiàn)：(1)在KMB17細(xì)胞上進(jìn)行33℃?zhèn)鞔?隨代次的增加,病毒的感染性滴度逐漸降低,使細(xì)胞達(dá)到75%病變的時(shí)間也逐漸延長(zhǎng)；而35℃條件下傳代后,病毒的感染性滴度穩(wěn)定,生長(zhǎng)曲線也沒(méi)有明顯變化。這說(shuō)明35℃更適合作為EV71在KMB17上的低溫傳代溫度。(2)利用有限稀釋法篩選出了感染性滴度較高、免疫原性較好的一個(gè)克隆,顱內(nèi)注射1-2日齡ICR乳鼠,乳鼠無(wú)發(fā)病和死亡情況；對(duì)腦、脊髓各段、肌肉等組織進(jìn)行病理學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),各組織無(wú)明顯的病理學(xué)損傷,僅在肌肉組織間隙出現(xiàn)了少量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn),腦部前額葉出現(xiàn)數(shù)個(gè)膠質(zhì)小結(jié)。(3)35℃及37℃兩個(gè)溫度條件下對(duì)FY23-K毒株進(jìn)行多次連續(xù)傳代后,樣品的抗原含量、感染性滴度及免疫原性沒(méi)有明顯變化；在35℃下從25代傳至35代,全基因組共出現(xiàn)3個(gè)堿基的突變,在VP1區(qū)出現(xiàn)1個(gè)堿基的突變；在37℃下從33代傳至50代,全基因組共出現(xiàn)3個(gè)堿基的突變,在VP1區(qū)出現(xiàn)1個(gè)堿基的突變。結(jié)果表示在33℃和37℃條件下連續(xù)傳代,毒株均具有較穩(wěn)定的遺傳學(xué)特性。(4)利用37℃第50代活病毒對(duì)4-6周齡ICR小鼠分別進(jìn)行腹腔、肌肉和皮下免疫,加免7天后,皮下注射陽(yáng)轉(zhuǎn)率僅有37.5%,GMT值為1：8；而其余兩組小鼠均達(dá)到了100%陽(yáng)轉(zhuǎn),但腹腔注射GMT值(1：119.42)明顯高于肌肉注射(1：42.22)。結(jié)果提示：腹腔注射免疫應(yīng)答效果最佳,可用于EV71減毒活疫苗的免疫原性初步評(píng)價(jià)。(5)利用35℃第28代樣品分別注射1-2日齡的ICR乳鼠和6個(gè)月的恒河?jì)牒锖蟀l(fā)現(xiàn)：乳鼠未產(chǎn)生發(fā)病和死亡情況,生長(zhǎng)發(fā)育也與對(duì)照組無(wú)明顯差異,與FY23株原始代次相比,乳鼠的致病性明顯降低；但感染恒河猴嬰猴后,在手足口出現(xiàn)了皰疹或疑似皰疹,并產(chǎn)生了明顯的病毒血癥,肺部也出現(xiàn)了肺水腫和肺充血的情況。結(jié)果提示：恒河猴嬰猴可作為EV71減毒活疫苗評(píng)價(jià)的敏感動(dòng)物模型,而乳鼠并不是最佳的動(dòng)物模型；FY23-K株35℃低溫傳至第28代,毒株仍未達(dá)到理想的減毒株要求,需繼續(xù)進(jìn)行減毒工作。(6)與原始代次相比,FY23-K毒株經(jīng)35℃?zhèn)鞔囵B(yǎng)至第25代后全基因組共有48個(gè)堿基突變,這些突變也都存在于第35代及37℃的第33代和50代,這些堿基的突變導(dǎo)致了10個(gè)氨基酸的變異,均有可能是毒株致病性減弱的原因；并初步推測(cè)VP1第145位可能是EV71的一個(gè)毒力相關(guān)位點(diǎn),從谷氨酸變?yōu)楣劝滨０?可以減弱EV71的毒力。
【關(guān)鍵詞】：EV71 減毒活疫苗 減毒機(jī)制 乳鼠致病性 動(dòng)物模型
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 摘要4-6
• abstract6-8
• 前言8-15
• 一 EV71及手足口病的流行概況8-9
• 二 EV71的病毒學(xué)和分子生物學(xué)特性9
• 三 EV71的治療現(xiàn)狀和疫苗的研發(fā)9-11
• 四 EV71動(dòng)物模型的研究現(xiàn)狀11-13
• 五 EV71的致病機(jī)制及減毒機(jī)制研究現(xiàn)狀13-14
• 六 本論文的研究思路、目的及意義14-15
• 實(shí)驗(yàn)材料與方法15-26
• 一 實(shí)驗(yàn)材料15-16
• 1 細(xì)胞與毒種15
• 2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物15
• 3 主要試劑15
• 4 實(shí)驗(yàn)耗材15-16
• 5 實(shí)驗(yàn)儀器16
• 二 實(shí)驗(yàn)方法16-22
• 1 細(xì)胞培養(yǎng)16-17
• 2 病毒的分離培養(yǎng)、鑒定和傳代擴(kuò)增17-22
• 三 對(duì)FY23-K株連續(xù)傳代樣品的評(píng)價(jià)22-26
• 結(jié)果及分析26
• 一 EV71臨床分離株的鑒定、篩選及其乳鼠體內(nèi)外傳代的研究26-29
• 1 病毒分離、鑒定及篩選26-28
• 2 臨床篩選株的相關(guān)研究28-29
• 二 EV71 FY23-K株體外不同溫度連續(xù)傳代其生物學(xué)特性的變化研究29-37
• 1 低溫傳代克隆的篩選29-32
• 2 不同溫度連續(xù)傳代后增殖特性分析及低溫條件的確定32-33
• 3 不同溫度連續(xù)多次傳代后生物學(xué)特性的變化研究33-37
• 三 連續(xù)傳代樣品免疫原性及安全性評(píng)價(jià)37-43
• 1 不同免疫方式對(duì)病毒中和抗體效價(jià)的影響37-38
• 2 病毒的嬰猴模型38-43
• 分析與討論43-49
• 小結(jié)49-50
• 參考文獻(xiàn)50-55
• 附錄 主要縮略詞55-56
• 致謝56-57
• 研究生簡(jiǎn)歷57-58

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1 楊e，

本文編號(hào)：507970