發(fā)布時間：2017-06-29 15:12

  本文關(guān)鍵詞：體內(nèi)獲得性耐藥進程中白念珠菌表型和基因表達變化的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：第一章體內(nèi)獲得性耐藥進程中白念珠菌表型變化的研究目的初步探索白念珠菌在體內(nèi)獲得性耐藥進程中出現(xiàn)的表型改變。方法選用6株同一來源的在體內(nèi)氟康唑長期作用下耐藥性逐漸增強的一組白念珠菌(編號分別為Ca1、2、5、8、14、17,其中Ca1為用藥前),進行形態(tài)學研究、菌絲形成實驗、表面疏水性(CSH)實驗以及絮凝實驗,探索白念珠菌在體內(nèi)獲得性耐藥這一過程中形態(tài)結(jié)構(gòu)、菌絲形成能力、黏附性的變化。結(jié)果實驗菌株的形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)以及細胞間的黏附能力未見明顯改變。除Ca17外,Ca2、5、8、14的菌絲形成率和CSH值都明顯比用藥前的敏感株Ca1高。結(jié)論實驗菌株的菌絲形成能力、與宿主或非生命基質(zhì)間的黏附能力在獲得性耐藥的過程中發(fā)生了相應的變化,這種改變的確切機制和意義尚有待進一步研究。第二章體內(nèi)獲得性耐藥進程中白念珠菌生物膜形成能力及其藥物敏感性變化的研究第一節(jié) 體內(nèi)獲得性耐藥進程中白念珠菌生物膜形成能力的研究目的對實驗菌株進行生物膜構(gòu)建及結(jié)構(gòu)觀察,并比較在體內(nèi)獲得性耐藥進程中各菌株生物膜形成能力的差異。方法用24孔組織培養(yǎng)板構(gòu)建第一章所用6株菌的生物膜,在不同的培養(yǎng)時間(2、4、8、12、24h)置于倒置顯微鏡下對生物膜的形成過程進行觀察；生物膜成熟后,用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察比較各菌株生物膜形成情況；用甲基四氮鹽(XTT)減低法評價生物膜生長過程中活力的變化。結(jié)果實驗菌株的生物膜形成能力存在差異,根據(jù)生物膜形成能力的不同,可將實驗菌株分為：形成能力弱(用藥前的敏感株和用藥后耐藥程度最高的菌株)和形成能力強(兩者之間的4株菌,可理解為敏感和高度穩(wěn)定耐藥之間的過渡狀態(tài))兩組。結(jié)論在獲得性耐藥這一進程中菌株的生物膜形成能力會發(fā)生改變,這種變化可能在對抗藥物選擇性壓力中扮演重要角色。第二節(jié)體內(nèi)獲得性耐藥進程中白念珠菌藥物敏感性變化的研究目的比較在體內(nèi)獲得性耐藥進程中,懸浮狀態(tài)菌與生物膜狀態(tài)菌對抗真菌藥物敏感性的差異。方法參照CLSI-M27-A3法推薦的酵母菌微量液基稀釋法對浮游狀態(tài)菌株進行常用抗真菌藥(氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、卡泊芬凈和兩性霉素B)藥物敏感性的測定；在96孔組織培養(yǎng)板中構(gòu)建白念珠菌生物膜的體外模型,參照Pierce的生物膜藥物敏感性試驗方法對其進行藥物敏感性測定。結(jié)果實驗菌株在浮游狀態(tài)對卡泊芬凈和兩性霉素B均維持敏感,對氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑的MIC值呈梯度性增高,其中Ca17對三種唑類藥物均耐藥。所有實驗菌株在形成生物膜后,對氟康唑呈高度耐藥,對伊曲康唑和伏立康唑的耐藥性也顯著增加,兩性霉素B可在較高濃度抑制白念珠菌生物膜,卡泊芬凈對白念珠菌生物膜仍維持敏感。結(jié)論在獲得性耐藥形成過程中,白念珠菌的藥物敏感性逐漸下降。與游離狀態(tài)相比,生物膜對藥物的抵抗性更強。唑類藥物耐藥程度增加最明顯；兩性霉素B在較高濃度可抑制白念珠菌生物膜,但其副作用大,臨床應用受限；卡泊芬凈對白念珠菌生物膜的殺傷作用較強,可作為臨床抗白念珠菌生物膜感染的一線藥物。第三章體內(nèi)獲得性耐藥進程中實驗菌株轉(zhuǎn)錄組測序和分析目的研究白念珠菌在體內(nèi)獲得性耐藥進程中基因的表達變化。方法對第一章所用6株株進行轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq),比較親本和MIC值最高的菌株之間的基因.表達差異以及隨MIC逐漸升高有顯著改變的基因；進行相關(guān)基因的功能注釋及生物學通路分析等研究。結(jié)果Ca17與Cal相比,共有55條基因表達差異明顯,其中有49條基因表達明顯上調(diào),6條基因表達明顯下調(diào)。上調(diào)幅度最大的是MDR1,其次是CDR1、CDR2等。首次發(fā)現(xiàn)在用藥前后出現(xiàn)明顯改變的基因有HWP1、GLX3、GEF2、 HSL1、MEWD9、OYE32、RPS19A、HST6、NAD4、NAD5、NAD4L、PGA31、GST3等。表達上調(diào)的差異基因多與耐藥和氧化應激相關(guān)。隨MIC逐漸升高有相關(guān)關(guān)系改變的基因共有655條,其中顯著改變的有303條,差異基因主要富集在與代謝有關(guān)的功能和生物通路上。結(jié)論白念珠菌獲得性耐藥的最終形成是多個基因在不同時段通過不同的機制共同作用的結(jié)果；藥物外排泵表達的增加對最終高度耐藥性的形成起到重要作用；藥物誘導可導致菌株的代謝途徑和代謝物發(fā)生變化,而改變原有的代謝過程可能是病原體產(chǎn)生耐藥性的機制之一。
【關(guān)鍵詞】：白念珠菌 獲得性耐藥 表型 生物膜 轉(zhuǎn)錄組測序
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R379.4
【目錄】：

• 中文摘要11-13
• 英文摘要13-16
• 前言16-18
• 參考文獻17-18
• 第一章 體內(nèi)獲得性耐藥進程中白念珠菌表型變化的研究18-28
• 1. 實驗材料18-20
• 1.1. 實驗菌株18
• 1.2. 主要試劑及培養(yǎng)基配方18-20
• 1.3. 主要儀器20
• 2. 實驗方法20-22
• 2.1. 菌落形態(tài)以及光學顯微鏡鏡下結(jié)構(gòu)20-21
• 2.2. 透射電鏡觀察菌株超微結(jié)構(gòu)21
• 2.3. 觀察實驗菌株的菌絲形成能力21
• 2.4. 表面疏水性(CSH)實驗21-22
• 2.5. 絮凝實驗22
• 3. 實驗結(jié)果22-25
• 3.1. 觀察菌落形態(tài)以及光學顯微鏡鏡下結(jié)構(gòu)22-23
• 3.2. 透射電鏡觀察菌株超微結(jié)構(gòu)23
• 3.3. 比較實驗菌株間的菌絲形成能力的差異23-24
• 3.4. 表面疏水性(CSH)實驗24-25
• 3.5. 絮凝實驗25
• 4. 討論25-27
• 參考文獻27-28
• 第二章 體內(nèi)獲得性耐藥進程中白念珠菌生物膜形成能力及其藥物敏感性變化的研究28-43
• 第一節(jié) 體內(nèi)獲得性耐藥進程中白念珠菌生物膜形成能力的研究28-36
• 1. 實驗材料與儀器設(shè)備28-29
• 1.1. 實驗菌株28
• 1.2. 主要試劑及培養(yǎng)基配方28-29
• 1.3. 主要儀器29
• 2. 實驗方法29-30
• 2.1. 白念珠菌生物膜制備29
• 2.2. 倒置顯微鏡觀察比較各菌株生物膜生長情況29-30
• 2.3. 共聚焦激光掃描顯微鏡下生物膜結(jié)構(gòu)觀察30
• 2.4. 白念珠菌生物膜活力測定30
• 3. 實驗結(jié)果30-34
• 3.1. 成熟白念珠菌生物膜外觀形態(tài)30
• 3.2. 倒置顯微鏡生物膜結(jié)構(gòu)觀察30-32
• 3.3. 共聚焦激光掃描顯微鏡生物膜結(jié)構(gòu)觀察32-33
• 3.4. 白念珠菌生物膜活力測定33-34
• 4. 討論34-35
• 參考文獻35-36
• 第二節(jié) 體內(nèi)獲得性耐藥進程中白念珠菌藥物敏感性變化的研究36-43
• 1. 實驗材料36
• 1.1. 實驗菌株36
• 1.2. 主要試劑及培養(yǎng)基配方36
• 1.3. 主要儀器36
• 2. 實驗方法36-39
• 2.1. 生物膜形成用菌懸液制備37
• 2.2. 96孔組織培養(yǎng)板生物膜制備37
• 2.3. 白念珠菌藥物敏感性測定37-39
• 3. 實驗結(jié)果39-40
• 3.1. 懸浮狀態(tài)白念珠菌藥物敏感性測定結(jié)果39
• 3.2. 生物膜狀態(tài)白念珠菌藥物敏感性測定結(jié)果39-40
• 3.3. 實驗菌株對受試藥物敏感性判讀40
• 4. 討論40-42
• 參考文獻42-43
• 第三章 實驗菌株轉(zhuǎn)錄組測序和分析43-56
• 1. 實驗材料43-44
• 1.1. 實驗菌株43
• 1.2. 試劑與儀器43-44
• 2. 實驗方法44-45
• 2.1. RNA提取44
• 2.2. 文庫構(gòu)建44
• 2.3. 簇生成(TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS)44
• 2.4. 上機測序(TruSeq SBS Kit v3-HS)44
• 2.5. 數(shù)據(jù)分析44-45
• 3. 實驗結(jié)果45-50
• 3.1. 過濾后的數(shù)據(jù)量45-46
• 3.2. 測序數(shù)據(jù)與參照基因組比對46
• 3.3. 用藥前敏感株和用藥后高度耐藥株基因表達的差異46-47
• 3.4. 相關(guān)性分析47-49
• 3.5. 差異基因的GO功能富集分析49
• 3.6. 差異基因的生物學通路分析49-50
• 4. 討論50-54
• 參考文獻54-56
• 全文小結(jié)56-58
• 綜述58-64
• 參考文獻62-64
• 在讀期間發(fā)表文章64-65
• 在讀期間參與會議65
• 在讀期間參加培訓65-66
• 致謝66-68

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