本文關(guān)鍵詞：人源抗TfR單鏈抗體的篩選、表達(dá)及初步活性分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：隨著全球人口老齡化的加劇,中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病(帕金森癥、阿爾茨海默癥、腦腫瘤等)的發(fā)病率逐年上升,已經(jīng)成為威脅人類健康的主要疾病之一。盡管經(jīng)過了幾十年的深入研究,治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的最大難題仍然是大分子藥物如何有效地通過血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)。血腦屏障主要由腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞間的緊密連接構(gòu)成,幾乎98%的小分子藥物和全部大分子藥物難以通過,從而嚴(yán)重限制了治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物的作用。近年來(lái)受體介導(dǎo)的腦內(nèi)靶向遞藥系統(tǒng)為大分子藥物治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病帶來(lái)了希望,其中,轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(Transferrin receptor,TfR)由于可以介導(dǎo)內(nèi)源性大分子轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin,Tf)跨越血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn),同時(shí)具備很強(qiáng)的外源分子載運(yùn)功能,因而一直是研究大分子藥物通過血腦屏障運(yùn)送的熱門靶標(biāo)。研究表明,利用大鼠Tf R的單克隆抗體OX26,可將偶聯(lián)的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)遞送入腦。然而目前報(bào)導(dǎo)的用于轉(zhuǎn)運(yùn)的TfR抗體多為鼠源或人源化的嵌合抗體,應(yīng)用于人體時(shí)不可避免地會(huì)產(chǎn)生一些不良反應(yīng)。因此,探尋活性更好、免疫原性更低的TfR人源抗體無(wú)疑更具優(yōu)勢(shì),并具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)室近年建立了基于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表面展示型人源單鏈抗體庫(kù),因其使用真核細(xì)胞進(jìn)行抗體分子展示,具有原核表達(dá)體系所不具備的翻譯后修飾功能,所以獲得的抗體分子更接近天然人源抗體,免疫原性更低。在本課題中,我們以人TfR為靶蛋白,對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面展示型人源單鏈抗體(single-chain antibody fragment variable,ScFv)庫(kù)進(jìn)行篩選,初步獲得能夠與TfR結(jié)合的ScFvs,進(jìn)一步利用獲得的ScFvs構(gòu)建分泌型抗體庫(kù),利用高表達(dá)TfR的細(xì)胞進(jìn)行功能性篩選,最后對(duì)篩選到的抗TfR抗體進(jìn)行重組表達(dá)及初步活性分析。本論文第一部分為哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示型人源ScFv抗體庫(kù)的篩選。首先提取展示型人源ScFv抗體質(zhì)粒庫(kù),然后將抗體質(zhì)粒庫(kù)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,培養(yǎng)約60 h后,單鏈抗體分子將在細(xì)胞膜表面進(jìn)行表達(dá)。將FITC標(biāo)記的人TfR與細(xì)胞混合,室溫條件下孵育1 h(TfR的終濃度為10nM)。反應(yīng)結(jié)束后,通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選,按照熒光強(qiáng)度收集約占總細(xì)胞數(shù)0.3%的陽(yáng)性細(xì)胞。從分選管中回收陽(yáng)性細(xì)胞,提取質(zhì)粒并擴(kuò)增,作為第二輪流式分選的抗體質(zhì)粒庫(kù)。在第二輪篩選時(shí),將TfR的終濃度降低至1nM,其余操作同第一輪篩選時(shí)一樣,按熒光強(qiáng)度收集細(xì)胞總數(shù)0.2%的陽(yáng)性細(xì)胞。通過降低TfR濃度的策略,篩選出的抗體親和力進(jìn)一步提高,將候選分子的范圍縮小,以利于后續(xù)的功能性篩選。第二輪流式分選后,對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列分析,并利用igblast數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)所得序列進(jìn)行鑒定分析,結(jié)果顯示,所得序列均為功能性人免疫球蛋白可變區(qū)基因,說(shuō)明從展示型全人源scfv抗體庫(kù)中篩選到的序列,可以作為進(jìn)一步功能性篩選的基礎(chǔ)文庫(kù)。本論文第二部分為哺乳動(dòng)物細(xì)胞分泌型人源scfv抗體庫(kù)的構(gòu)建與篩選。首先對(duì)第二輪流式分選后的陽(yáng)性細(xì)胞提取質(zhì)粒并擴(kuò)增,以其作為模板,根據(jù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示型人源scfv抗體庫(kù)構(gòu)建時(shí)所用的簡(jiǎn)并引物,設(shè)計(jì)含有bspqⅠ酶切位點(diǎn)的28對(duì)通用引物,對(duì)初篩獲得的單鏈抗體基因進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction,pcr)擴(kuò)增。回收pcr擴(kuò)增產(chǎn)物,以限制性內(nèi)切酶bspqi分別對(duì)pcr產(chǎn)物和sgls載體進(jìn)行酶切消化,將酶切后的scfv片段插入哺乳動(dòng)物細(xì)胞分泌型表達(dá)載體sgls中,使scfv融合于載體上的lc片段上游,構(gòu)建分泌型抗體質(zhì)粒庫(kù)。載體上所帶有的lc片段,一方面可作為純化標(biāo)簽幫助純化,同時(shí)有助于提高表達(dá)水平,并且在功能研究時(shí),可作為scfv攜帶藥物的替代物,便于考察scfv能否攜帶lc通過bbb。將構(gòu)建好的分泌型人源scfv抗體質(zhì)粒庫(kù),通過電穿孔轉(zhuǎn)染cho-k1細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后細(xì)胞分裝于96孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)21d。以抗人igg多抗包被,elisa分析細(xì)胞培養(yǎng)上清,篩選出高表達(dá)細(xì)胞株。同時(shí),使用penter-tfr質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞,培養(yǎng)60h,獲得可以在細(xì)胞膜表面高表達(dá)tfr的篩選用細(xì)胞,對(duì)候選細(xì)胞株培養(yǎng)上清進(jìn)行流式分析,篩選出表達(dá)上清能夠與tfr有效結(jié)合的4株陽(yáng)性細(xì)胞。提取細(xì)胞基因組dna,pcr擴(kuò)增scfv基因后連入t載體進(jìn)行測(cè)序分析,結(jié)果表明,獲得了兩個(gè)不同的抗tfr單鏈抗體基因序列。進(jìn)一步通過igblast序列分析,結(jié)果顯示兩條序列均為全新的功能性人免疫球蛋白可變區(qū)基因。本論文第三部分為人源抗tfr-scfv-lc融合蛋白的表達(dá)及活性鑒定。分別將陽(yáng)性細(xì)胞株2f8與陽(yáng)性細(xì)胞株5d9接種至cd-cho培養(yǎng)基中,培養(yǎng)7d后,收取上清經(jīng)0.45μm濾膜過濾,以captol親和層析柱對(duì)蛋白進(jìn)行純化。純化后的蛋白以bca蛋白定量試劑盒測(cè)定濃度,2f8號(hào)融合蛋白的濃度為0.6mg/ml,5d9號(hào)融合蛋白的濃度為0.8mg/ml。將純化后收集的兩個(gè)蛋白通過sds-page進(jìn)行鑒定,結(jié)果顯示均在38kda附近出現(xiàn)目的條帶,與預(yù)期大小相符。以westernblot對(duì)蛋白進(jìn)行鑒定,結(jié)果表明這兩個(gè)融合蛋白均可與hrp標(biāo)記的山羊抗人igg特異性結(jié)合。將bca蛋白定量后的兩個(gè)目標(biāo)蛋白通過fortebiooctet進(jìn)行親和力檢測(cè),結(jié)果顯示2f8融合蛋白與人tfr的親和常數(shù)為3.18×10-7mol/l,5d9融合蛋白與人tfr的親和常數(shù)為7.90×10-7mol/l,2f8融合蛋白的親和力略優(yōu)于5d9融合蛋白。將fitc標(biāo)記的兩個(gè)融合蛋白分別與天然表達(dá)tfr的hcmec/d3細(xì)胞共孵育,進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析,結(jié)果顯示二者均可與hCMEC/D3細(xì)胞結(jié)合,且2F8融合蛋白的結(jié)合更強(qiáng),這與之前融合蛋白親和常數(shù)測(cè)定結(jié)果相吻合。進(jìn)一步地,將FITC標(biāo)記的融合蛋白與hCMEC/D3細(xì)胞共孵育后,置于激光共聚焦顯微鏡下觀測(cè),結(jié)果顯示兩個(gè)融合蛋白均可與hCMEC/D3細(xì)胞表面的TfR結(jié)合,并通過TfR介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入hCMEC/D3細(xì)胞,說(shuō)明篩選到的ScFv分子具有攜帶大分子通過血腦屏障的潛力。綜上所述,我們?cè)诓溉閯?dòng)物細(xì)胞展示型人源ScFv抗體庫(kù)的基礎(chǔ)上,成功構(gòu)建了人源分泌型ScFv-LC抗體庫(kù),并通過篩選獲得了兩個(gè)與TfR具有較好親和力的全新ScFv,說(shuō)明這種篩選模式是有效的,為同類分子的篩選提供了方法。純化獲得的兩個(gè)融合蛋白均可與hCMEC/D3細(xì)胞結(jié)合并通過TfR介導(dǎo)進(jìn)入胞內(nèi),為后續(xù)體內(nèi)跨血腦屏障運(yùn)送的研究奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：血腦屏障 轉(zhuǎn)鐵蛋白受體 抗體庫(kù) 單鏈抗體 融合蛋白
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R392.11
【目錄】：

• 英文縮略詞表4-6
• 摘要6-9
• Abstract9-13
• 前言13-15
• 第一部分 哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示型人源Sc Fv抗體庫(kù)的篩選15-25
• 1 材料與方法15-21
• 2 結(jié)果21-23
• 3 討論23-24
• 4 小結(jié)24-25
• 第二部分 分泌型人源Sc Fv抗體庫(kù)的構(gòu)建與篩選25-45
• 1 材料與方法25-35
• 2 結(jié)果35-43
• 3 討論43-44
• 4 小結(jié)44-45
• 第三部分 人源抗Tf R-Sc Fv-LC融合蛋白的表達(dá)及活性鑒定45-59
• 1 材料與方法45-52
• 2 結(jié)果52-57
• 3 討論57-58
• 4 小結(jié)58-59
• 結(jié)論59-61
• 參考文獻(xiàn)61-64
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷64-65
• 致謝65-66
• 綜述66-74
• 參考文獻(xiàn)71-74

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本文編號(hào)：491249