本文關鍵詞：人源抗TfR單鏈抗體的篩選、表達及初步活性分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：隨著全球人口老齡化的加劇,中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病(帕金森癥、阿爾茨海默癥、腦腫瘤等)的發(fā)病率逐年上升,已經(jīng)成為威脅人類健康的主要疾病之一。盡管經(jīng)過了幾十年的深入研究,治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的最大難題仍然是大分子藥物如何有效地通過血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)。血腦屏障主要由腦毛細血管內皮細胞及細胞間的緊密連接構成,幾乎98%的小分子藥物和全部大分子藥物難以通過,從而嚴重限制了治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物的作用。近年來受體介導的腦內靶向遞藥系統(tǒng)為大分子藥物治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病帶來了希望,其中,轉鐵蛋白受體(Transferrin receptor,TfR)由于可以介導內源性大分子轉鐵蛋白(Transferrin,Tf)跨越血腦屏障轉運,同時具備很強的外源分子載運功能,因而一直是研究大分子藥物通過血腦屏障運送的熱門靶標。研究表明,利用大鼠Tf R的單克隆抗體OX26,可將偶聯(lián)的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)遞送入腦。然而目前報導的用于轉運的TfR抗體多為鼠源或人源化的嵌合抗體,應用于人體時不可避免地會產(chǎn)生一些不良反應。因此,探尋活性更好、免疫原性更低的TfR人源抗體無疑更具優(yōu)勢,并具有重要的應用價值。本實驗室近年建立了基于哺乳動物細胞的表面展示型人源單鏈抗體庫,因其使用真核細胞進行抗體分子展示,具有原核表達體系所不具備的翻譯后修飾功能,所以獲得的抗體分子更接近天然人源抗體,免疫原性更低。在本課題中,我們以人TfR為靶蛋白,對哺乳動物細胞表面展示型人源單鏈抗體(single-chain antibody fragment variable,ScFv)庫進行篩選,初步獲得能夠與TfR結合的ScFvs,進一步利用獲得的ScFvs構建分泌型抗體庫,利用高表達TfR的細胞進行功能性篩選,最后對篩選到的抗TfR抗體進行重組表達及初步活性分析。本論文第一部分為哺乳動物細胞展示型人源ScFv抗體庫的篩選。首先提取展示型人源ScFv抗體質粒庫,然后將抗體質粒庫瞬時轉染293T細胞,培養(yǎng)約60 h后,單鏈抗體分子將在細胞膜表面進行表達。將FITC標記的人TfR與細胞混合,室溫條件下孵育1 h(TfR的終濃度為10nM)。反應結束后,通過流式細胞儀進行分選,按照熒光強度收集約占總細胞數(shù)0.3%的陽性細胞。從分選管中回收陽性細胞,提取質粒并擴增,作為第二輪流式分選的抗體質粒庫。在第二輪篩選時,將TfR的終濃度降低至1nM,其余操作同第一輪篩選時一樣,按熒光強度收集細胞總數(shù)0.2%的陽性細胞。通過降低TfR濃度的策略,篩選出的抗體親和力進一步提高,將候選分子的范圍縮小,以利于后續(xù)的功能性篩選。第二輪流式分選后,對陽性克隆進行序列分析,并利用igblast數(shù)據(jù)庫對所得序列進行鑒定分析,結果顯示,所得序列均為功能性人免疫球蛋白可變區(qū)基因,說明從展示型全人源scfv抗體庫中篩選到的序列,可以作為進一步功能性篩選的基礎文庫。本論文第二部分為哺乳動物細胞分泌型人源scfv抗體庫的構建與篩選。首先對第二輪流式分選后的陽性細胞提取質粒并擴增,以其作為模板,根據(jù)哺乳動物細胞展示型人源scfv抗體庫構建時所用的簡并引物,設計含有bspqⅠ酶切位點的28對通用引物,對初篩獲得的單鏈抗體基因進行聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction,pcr)擴增�；厥誴cr擴增產(chǎn)物,以限制性內切酶bspqi分別對pcr產(chǎn)物和sgls載體進行酶切消化,將酶切后的scfv片段插入哺乳動物細胞分泌型表達載體sgls中,使scfv融合于載體上的lc片段上游,構建分泌型抗體質粒庫。載體上所帶有的lc片段,一方面可作為純化標簽幫助純化,同時有助于提高表達水平,并且在功能研究時,可作為scfv攜帶藥物的替代物,便于考察scfv能否攜帶lc通過bbb。將構建好的分泌型人源scfv抗體質粒庫,通過電穿孔轉染cho-k1細胞,轉染后細胞分裝于96孔培養(yǎng)板內培養(yǎng)21d。以抗人igg多抗包被,elisa分析細胞培養(yǎng)上清,篩選出高表達細胞株。同時,使用penter-tfr質粒瞬時轉染293t細胞,培養(yǎng)60h,獲得可以在細胞膜表面高表達tfr的篩選用細胞,對候選細胞株培養(yǎng)上清進行流式分析,篩選出表達上清能夠與tfr有效結合的4株陽性細胞。提取細胞基因組dna,pcr擴增scfv基因后連入t載體進行測序分析,結果表明,獲得了兩個不同的抗tfr單鏈抗體基因序列。進一步通過igblast序列分析,結果顯示兩條序列均為全新的功能性人免疫球蛋白可變區(qū)基因。本論文第三部分為人源抗tfr-scfv-lc融合蛋白的表達及活性鑒定。分別將陽性細胞株2f8與陽性細胞株5d9接種至cd-cho培養(yǎng)基中,培養(yǎng)7d后,收取上清經(jīng)0.45μm濾膜過濾,以captol親和層析柱對蛋白進行純化。純化后的蛋白以bca蛋白定量試劑盒測定濃度,2f8號融合蛋白的濃度為0.6mg/ml,5d9號融合蛋白的濃度為0.8mg/ml。將純化后收集的兩個蛋白通過sds-page進行鑒定,結果顯示均在38kda附近出現(xiàn)目的條帶,與預期大小相符。以westernblot對蛋白進行鑒定,結果表明這兩個融合蛋白均可與hrp標記的山羊抗人igg特異性結合。將bca蛋白定量后的兩個目標蛋白通過fortebiooctet進行親和力檢測,結果顯示2f8融合蛋白與人tfr的親和常數(shù)為3.18×10-7mol/l,5d9融合蛋白與人tfr的親和常數(shù)為7.90×10-7mol/l,2f8融合蛋白的親和力略優(yōu)于5d9融合蛋白。將fitc標記的兩個融合蛋白分別與天然表達tfr的hcmec/d3細胞共孵育,進行流式細胞術分析,結果顯示二者均可與hCMEC/D3細胞結合,且2F8融合蛋白的結合更強,這與之前融合蛋白親和常數(shù)測定結果相吻合。進一步地,將FITC標記的融合蛋白與hCMEC/D3細胞共孵育后,置于激光共聚焦顯微鏡下觀測,結果顯示兩個融合蛋白均可與hCMEC/D3細胞表面的TfR結合,并通過TfR介導的內吞作用進入hCMEC/D3細胞,說明篩選到的ScFv分子具有攜帶大分子通過血腦屏障的潛力。綜上所述,我們在哺乳動物細胞展示型人源ScFv抗體庫的基礎上,成功構建了人源分泌型ScFv-LC抗體庫,并通過篩選獲得了兩個與TfR具有較好親和力的全新ScFv,說明這種篩選模式是有效的,為同類分子的篩選提供了方法。純化獲得的兩個融合蛋白均可與hCMEC/D3細胞結合并通過TfR介導進入胞內,為后續(xù)體內跨血腦屏障運送的研究奠定了基礎。
【關鍵詞】：血腦屏障 轉鐵蛋白受體 抗體庫 單鏈抗體 融合蛋白
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R392.11
【目錄】：

• 英文縮略詞表4-6
• 摘要6-9
• Abstract9-13
• 前言13-15
• 第一部分 哺乳動物細胞展示型人源Sc Fv抗體庫的篩選15-25
• 1 材料與方法15-21
• 2 結果21-23
• 3 討論23-24
• 4 小結24-25
• 第二部分 分泌型人源Sc Fv抗體庫的構建與篩選25-45
• 1 材料與方法25-35
• 2 結果35-43
• 3 討論43-44
• 4 小結44-45
• 第三部分 人源抗Tf R-Sc Fv-LC融合蛋白的表達及活性鑒定45-59
• 1 材料與方法45-52
• 2 結果52-57
• 3 討論57-58
• 4 小結58-59
• 結論59-61
• 參考文獻61-64
• 個人簡歷64-65
• 致謝65-66
• 綜述66-74
• 參考文獻71-74

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 張志祥,姚其正;融合蛋白—— 一種新的生物工程技術[J];藥物生物技術;2001年01期

2 李大鵬,王莉,衛(wèi)紅飛,張培因,吳秀麗,萬敏,王燕媚,王愛麗,楊世杰,王麗穎;熱休克蛋白65-MUC1融合蛋白對小鼠干擾素γ產(chǎn)生細胞的誘生作用[J];吉林大學學報(醫(yī)學版);2004年03期

3 曲梅花;于繼云;胡美茹;王守訓;黎燕;;人CD28-Fc融合蛋白在真核細胞中的表達與純化[J];醫(yī)學分子生物學雜志;2005年05期

4 張榮媛;王靜;李茜;王航雁;;融合蛋白技術及臨床應用進展[J];國際生物制品學雜志;2006年02期

5 何火聰;劉樹滔;潘劍茹;陳躬瑞;饒平凡;;GST-TAT-GFP融合蛋白的表達、純化及鑒定[J];福建醫(yī)科大學學報;2006年04期

6 嚴世榮;閆瑩;孫軍;宗義強;王小波;屈伸;;TAT-EGFP融合蛋白對小鼠生物膜穿透性的研究[J];藥物生物技術;2007年05期

7 馬大龍,郭淑君,鄭蕾,陳慰峰;在大腸桿菌高效表達人白細胞介素4融合蛋白[J];北京醫(yī)科大學學報;1990年04期

8 楊和平，，黃宗之;融合蛋白的生產(chǎn)技術[J];中國動脈硬化雜志;1994年04期

9 廉德君,許根俊;一種改進的融合蛋白親和層析純化方法[J];生物化學與生物物理進展;1998年03期

10 李文平,許靜,隋建華,宋增璇;抗人纖維蛋白單鏈抗體-鏈親和素融合蛋白的穩(wěn)定性及對動物纖維蛋白的識別[J];中國免疫學雜志;1999年09期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 祝強;黃智華;黃予良;覃揚;;rhEPO-L-Fc融合蛋白的克隆、表達、生物活性分析及初步藥代動力學研究[A];第九屆西南三省一市生物化學與分子生物學學術交流會論文集[C];2008年

2 高基民;呂建新;;白細胞介素15/鏈親和素融合蛋白的制備及活性測定[A];中國遺傳學會第八次代表大會暨學術討論會論文摘要匯編（2004-2008）[C];2008年

3 孫益;葛霽光;;人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子和可溶性人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子受體的融合蛋白的表達[A];中國生物醫(yī)學工程學會第六次會員代表大會暨學術會議論文摘要匯編[C];2004年

4 楊振泉;劉巧泉;于恒秀;潘志明;焦新安;;新城疫病毒融合蛋白在轉基因水稻葉片中的表達及其免疫原性[A];中國生物工程學會第四次會員代表大會暨學術討論會論文摘要集[C];2005年

5 陳麗華;王強;侯萬國;;不同鏈接劑修飾的融合谷胱甘肽活性的研究[A];中國化學會第十二屆膠體與界面化學會議論文摘要集[C];2009年

6 王榮智;汪世華;林文雄;;抗體與酶融合技術研究[A];第十屆全國殺蟲微生物學術研討會暨全國生物農(nóng)藥與化學生物學研究與產(chǎn)業(yè)化會議論文摘要集[C];2006年

7 劉忠華;丁元生;胡忠義;;結核分枝桿菌38kD-16kD融合蛋白在大腸桿菌中的高效表達[A];2007年中國防癆協(xié)會全國學術會議論文集[C];2007年

8 祖東;徐春曉;黃國錦;姚立紅;陳愛君;朱宏建;劉沐榮;張智清;;TNFRI∶IgGFc融合蛋白基因的構建及其在大腸桿菌中的高效表達[A];首屆長三角科技論壇——長三角生物醫(yī)藥發(fā)展論壇論文集[C];2004年

9 劉先俊;劉方欣;黎波;周輝云;王琴琴;;胸腺素α1與復合α干擾素融合蛋白的表達及其生物學活性[A];第九屆西南三省一市生物化學與分子生物學學術交流會論文集[C];2008年

10 楊燕凌;;酶(蛋白)融合技術研究[A];華東地區(qū)農(nóng)學會學術年會暨福建省科協(xié)第七屆學術年會農(nóng)業(yè)分會場論文集[C];2007年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 記者 朱敏麗　通訊員 潘越;中國醫(yī)藥城首批融合蛋白試劑出口[N];泰州日報;2010年

2 吳紅梅;我省首批融合蛋白試劑出口美國[N];新華日報;2010年

3 金陵;融合蛋白試劑首次出口美國[N];中國醫(yī)藥報;2010年

4 記者 毛黎;美開發(fā)出癌癥治療新技術[N];科技日報;2009年

5 常麗君;線粒體融合蛋白2決定細胞生死[N];科技日報;2013年

6 通訊員 沈季 記者 張兆軍;抗腫瘤融合蛋白進入臨床試驗[N];科技日報;2005年

7 記者 張曄　通訊員 劉寧春;一種有效治療冠心病的融合蛋白發(fā)現(xiàn)[N];科技日報;2009年

8 ;吉大抗腫瘤生物工程新藥進入臨床試驗[N];中國高新技術產(chǎn)業(yè)導報;2005年

9 毛磊;新型抗流感藥物有望面世[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2003年

10 曹麗君;英研制出新型抗流感藥物[N];中國中醫(yī)藥報;2003年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 劉星;赭曲霉毒素A納米抗體的免疫學檢測性能及分子作用機理研究[D];南昌大學;2015年

2 吳芩;Npu DnaE intein的結構與機理研究和蛋白質雙模式成像探針的制備及應用[D];中國科學技術大學;2015年

3 錢凱;胰高血糖素樣肽-1與人血清白蛋白融合蛋白的設計與改造[D];江南大學;2015年

4 司成業(yè);基于融合蛋白構建智能超分子組裝體[D];吉林大學;2016年

5 范季瀛;候選藥物重組融合蛋白VAS-TRAIL的研究[D];華東理工大學;2016年

6 高冬芳;纖維素酶作為融合蛋白在大腸桿菌中的應用及其分泌機制的研究[D];山東大學;2016年

7 宋琳琳;Ub-HBcAg-CTP融合蛋白誘導特異性細胞毒性T淋巴細胞反應的實驗研究[D];上海交通大學;2015年

8 劉寶平;家蠶表達的霍亂病毒B亞基融合蛋白防治1型糖尿病和阿爾茨海默癥研究[D];浙江大學;2015年

9 周小虎;線粒體融合蛋白2在肝細胞肝癌中作用機制的研究[D];浙江大學;2016年

10 陸遠;EGFR靶向單鏈抗體制備及介導siRNA內化NSCLC細胞的生物學效應[D];第四軍醫(yī)大學;2016年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 郭海強;p53~(N239S)蛋白的表達與純化以及癌基因Kras~(G12D)與p53~(236S)促進小鼠罹患肺癌[D];昆明理工大學;2015年

2 胡湘云;新城疫病毒融合蛋白納米抗體的篩選與鑒定[D];西北農(nóng)林科技大學;2015年

3 張銀閣;熒光標記重組乙型肝炎病毒載體的構建[D];河北醫(yī)科大學;2015年

4 彭金秀;結核分枝桿菌持續(xù)感染致T細胞功能障礙的研究及融合蛋白AEMD和LT70的構建[D];蘭州大學;2015年

5 崔連振;利用重組凝集素篩選腫瘤相關蛋白及其功能研究[D];浙江理工大學;2016年

6 耿小雪;對蝦白斑綜合征病毒囊膜蛋白VP28和VP26與細胞穿膜肽的融合蛋白在畢赤酵母中的組成型表達研究[D];中國海洋大學;2015年

7 皇超英;NJA-1菌中DON降解酶基因的克隆、表達及特性研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2010年

8 張冬冬;IL-1RA-PEP融合蛋白功能及對缺血性再灌注腦損傷的治療作用研究[D];安徽醫(yī)科大學;2016年

9 楊懿;長效GLP-1-IgG2σ Fc融合蛋白的真核表達與生物活性鑒定[D];安徽醫(yī)科大學;2016年

10 米夢丹;透明顫菌血紅蛋白作為可視化標簽在蛋白純化過程中的應用[D];吉林大學;2016年

  本文關鍵詞：人源抗TfR單鏈抗體的篩選、表達及初步活性分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：491249