本文關(guān)鍵詞：Fancd2os基因在小鼠不同組織中的表達(dá)譜分析及其真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:哺乳動物的精子發(fā)生是極其復(fù)雜而精細(xì)的過程,是睪丸組織各類細(xì)胞與細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境相互作用的結(jié)果,其中睪丸組織特異表達(dá)或者高表達(dá)基因可能起著關(guān)鍵性的作用。本研究在課題組前期工作基礎(chǔ)上,通過生物信息學(xué)方法分析Fancd2os基因及其編碼蛋白的基本性質(zhì);隨后應(yīng)用分子生物學(xué)基本技術(shù)從m RNA和蛋白質(zhì)水平分析Fancd2os基因在小鼠不同的組織和不同發(fā)育階段的睪丸組織中的表達(dá),利用組織化學(xué)染色技術(shù)對Fancd2os蛋白進(jìn)行細(xì)胞定位;并構(gòu)建Fancd2os基因的真核表達(dá)載體初步探討其可能的生物學(xué)作用,為深入研究Fancd2os基因的功能奠定基礎(chǔ)。方法:1、利用生物信息學(xué)軟件和相關(guān)數(shù)據(jù)庫對Fancd2os基因及其編碼蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析和功能預(yù)測,包括同源性、進(jìn)化樹、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、跨膜區(qū)、親疏水性、信號肽、亞細(xì)胞定位、翻譯后修飾位點、磷酸化位點、抗原表位位點、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)、相互作用、電子表達(dá)譜以及GEO(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫等分析和預(yù)測。2、應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測Fancd2os m RNA在小鼠七種組織的表達(dá)情況。3、應(yīng)用免疫印跡(Western blotting)技術(shù)分析Fancd2os蛋白在小鼠七種組織中的表達(dá)水平。4、利用實時定量PCR(real-time PCR)分析Fancd2os m RNA在不同發(fā)育階段的睪丸組織中的表達(dá)。5、應(yīng)用免疫印跡(Western blotting)技術(shù)分析Fancd2os蛋白在不同發(fā)育階段的睪丸組織中的表達(dá)。6、通過免疫組織化學(xué)染色檢測Fancd2os蛋白在小鼠睪丸組織中的細(xì)胞定位。7、利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建Fancd2os基因的真核表達(dá)載體p3×FLAG-CMV-14-Fancd2os,并進(jìn)行鑒定。8、將重組質(zhì)粒通過脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,并分別采用反轉(zhuǎn)錄PCR和Western blotting檢測Fancd2os基因的表達(dá)情況。結(jié)果:1、生物信息學(xué)分析提示Fancd2os基因位于小鼠6號染色體E3部分,c DNA全長為1358bp,開放閱讀框包含536個核苷酸,編碼產(chǎn)生含178個氨基酸的蛋白質(zhì)產(chǎn)物,酸性氨基酸13個,堿性氨基酸23個,理論等電點為9.56,不穩(wěn)定系數(shù)為51.95;小鼠Fancd2os蛋白的氨基酸序列與大鼠、牛、人的相似性分別為97.8%、93.3%、92.1%;蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明該蛋白質(zhì)含有55.62%的無規(guī)則卷曲,30.34%的α螺旋;應(yīng)用PSORT預(yù)測Fancd2os蛋白定位在細(xì)胞漿可能性最大,預(yù)測值為45%,該蛋白無信號肽序列和跨膜序列,為親水性蛋白;磷酸化位點分析預(yù)測Fancd2os蛋白質(zhì)存在8個色氨酸磷酸化位點和5個蘇氨酸磷酸化位點,采用Motif Scan預(yù)測結(jié)果提示Fancd2os蛋白含有10個翻譯后修飾位點,分別是1個c AMP磷酸化位點、3個CKⅡ磷酸化位點和6個PKC磷酸化位點;EST電子表達(dá)譜顯示Fancd2os基因主要在睪丸組織中表達(dá),腎臟組織微弱表達(dá);GEO數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果提示Fancd2os基因的表達(dá)可能與線粒體Clp P蛋白酶的表達(dá)密切相關(guān);MGI Interaction Explorer數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)Fancd2os基因與95個mi RNA具有相互作用。2、半定量RT-PCR分析表明Fancd2os基因在睪丸組織中的表達(dá)非常顯著,腎臟組織表達(dá)微弱,其它他組織未檢測到表達(dá)條帶。3、Western blotting結(jié)果表明該蛋白主要表達(dá)于睪丸組織,腎臟也有微弱表達(dá),其它組織未見明顯陽性條帶。4、實時定量PCR檢測結(jié)果表明Fancd2os基因在不同周齡的小鼠睪丸組織中具有顯著的階段特異性表達(dá)特征,以8周齡小鼠表達(dá)水平最高。5、Western blotting結(jié)果顯示Fancd2os蛋白在不同周齡的小鼠睪丸組織中具有明顯的階段特異性,以8周齡小鼠表達(dá)水平最高。6、免疫組織化學(xué)染色顯示Fancd2os蛋白在睪丸曲細(xì)精管中定位主要集中在精母細(xì)胞和圓形精子細(xì)胞的胞質(zhì)中。7、PCR、雙酶切圖譜和DNA測序結(jié)果均顯示Fancd2os基因真核表達(dá)載p3×FLAG-CMV-14-Fancd2os構(gòu)建成功。8、反轉(zhuǎn)錄PCR和Western blotting結(jié)果表明p3×FLAG-CMV-14-Fancd2os重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后,Fancd2os基因可以表達(dá)其蛋白產(chǎn)物。結(jié)論:Fancd2os基因及其編碼蛋白在小鼠多種組織中具有顯著的差異表達(dá),為睪丸組織高表達(dá)基因,并且其m RNA及蛋白的表達(dá)水平隨著小鼠睪丸的發(fā)育過程呈上調(diào)趨勢。結(jié)合生物信息學(xué)分析結(jié)果,推測Fancd2os基因可能與睪丸組織的發(fā)育及精子發(fā)生過程有關(guān),利用本研究成功構(gòu)建的Fancd2os基因真核表達(dá)載體可以進(jìn)一步在細(xì)胞水平探討該基因的功能,尤其是在精子發(fā)生中的具體作用。
【關(guān)鍵詞】：Fancd2os 生物信息學(xué) 睪丸組織 精子發(fā)生
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R321
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• Abstract8-11
• 常用縮寫詞中英文對照表11-13
• 前言13-15
• 1 材料與方法15-31
• 1.1 實驗材料15-20
• 1.2 研究方法20-31
• 2 結(jié)果31-49
• 2.1 Fancd2os基因及編碼蛋白的生物信息學(xué)分析31-40
• 2.2 Fancd2os基因的組織特異性表達(dá)40-41
• 2.3 Fancd2os基因在小鼠睪丸組織的階段特異性表達(dá)41-43
• 2.4 Fancd2os蛋白在小鼠睪丸組織中的細(xì)胞定位43-45
• 2.5 Fancd2os基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定45-47
• 2.6 重組質(zhì)粒在HEK293T細(xì)胞中的表達(dá)47-49
• 3 討論49-53
• 4 結(jié)論53-54
• 參考文獻(xiàn)54-57
• 綜述57-72
• 參考文獻(xiàn)67-72
• 致謝72-73
• 在學(xué)期間承擔(dān)/參與的科研課題與研究成果73-74
• 個人簡歷74

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 景花;宋沁馨;周國華;;MicroRNA定量檢測方法的研究進(jìn)展[J];遺傳;2010年01期

2 冉茂良;陳斌;尹杰;楊岸奇;蔣明;;睪丸發(fā)育和精子生成相關(guān)miRNA研究進(jìn)展[J];遺傳;2014年07期

  本文關(guān)鍵詞：Fancd2os基因在小鼠不同組織中的表達(dá)譜分析及其真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：407679