星狀病毒(Human astrovirus,HAstV)是通過引起小腸上皮細胞凋亡從而導(dǎo)致嬰幼兒腹瀉的重要病原體。課題組前期研究表明HAstV非結(jié)構(gòu)蛋白nsP1aC末端蛋白nsP1a/4是誘導(dǎo)凋亡的主要功能性蛋白,可能含有與凋亡相關(guān)的重要結(jié)構(gòu)域。為了探索nsP1a/4蛋白中的凋亡結(jié)構(gòu)域,本研究采用綠色熒光蛋白真核表達載體,根據(jù)nsP1a/4蛋白功能性結(jié)構(gòu)域的位置,選擇不同的刪除位點,構(gòu)建nsP1a/4蛋白及不同結(jié)構(gòu)域刪除的nsP1a/4蛋白突變體,并將其轉(zhuǎn)染BHK21細胞,在轉(zhuǎn)染的24～72h檢測重組蛋白在細胞內(nèi)的表達并進行初步分析。結(jié)果顯示,24h后熒光顯微鏡下可觀察到融合nsP1a/4蛋白和其突變體的綠色熒光。Western blot分析結(jié)果顯示7種融合蛋白均能在體外細胞中高效表達,72h表達量明顯高于48h。這些結(jié)果表明我們構(gòu)建的nsP1a/4蛋白及其刪除突變體可在BHK21細胞中表達,可用于HAstV非結(jié)構(gòu)蛋白nsP1a/4的凋亡結(jié)構(gòu)域研究,從而為進一步研究HAstV分子致病機制提供研究平臺。

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【文章目錄】：
材料與方法
    1 HAstV nsP1a/4蛋白不同刪除突變位點的選擇
    2 不同刪除突變體真核表達載體構(gòu)建
        2.1 引物設(shè)計
        2.2 目的片段擴增及雙酶切反應(yīng)
        2.3 重組體的連接、轉(zhuǎn)化
        2.4 重組體鑒定
    3 重組刪除突變體在體外BHK21細胞中的表達分析
        3.1 重組體突變體的轉(zhuǎn)染
        3.2 重組蛋白在細胞內(nèi)的瞬時表達檢測
結(jié)果
    1 7種重組體的酶切鑒定
    2熒光顯微鏡下重組蛋白的表達
    3 Western blot檢測細胞內(nèi)重組蛋白表達
討論



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