目的構(gòu)建表達(dá)嵌合腸道病毒71型(enterovirus 71,EV71)中和表位VP1-SP70(E1)和VP2-141(E2)融合蛋白HBc-E1/2的重組恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis,MS),并評(píng)價(jià)其在小鼠體內(nèi)的免疫原性。方法 PCR法擴(kuò)增目的基因HBc-E1/2,并克隆至E.coli-分枝桿菌穿梭載體pMV261,構(gòu)建重組質(zhì)粒pMV261-HBc-E1/2,電轉(zhuǎn)化至mc2 155(MS野生株ATCC 607的突變體),獲得重組菌pMV261-HBc-E1/2/mc2 155,將其經(jīng)腹腔免疫BALB/c小鼠,間接ELISA法檢測(cè)小鼠血清抗體效價(jià)。結(jié)果經(jīng)雙酶切及測(cè)序鑒定,重組質(zhì)粒pMV261-HBc-E1/2構(gòu)建正確。重組菌pMV261-HBc-E1/2/mc2 155表達(dá)產(chǎn)物可與E1多肽、E2多肽及EV71滅活疫苗小鼠免疫血清發(fā)生特異性結(jié)合,且在相對(duì)分子質(zhì)量約27 500和55 000處可見特異性蛋白結(jié)合條帶。免疫小鼠血清抗E1及E2表位抗體效價(jià)均為1∶1 600。結(jié)論成功構(gòu)建了呈遞HBc-E1/2的重組MS,可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生EV71的特異性抗體。本實(shí)...

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圖1HBc-E1/2基因PCR產(chǎn)物電泳圖

HBc-E1/2基因PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見650bp的目的條帶，大小與預(yù)期一致，見圖1。2.2重組質(zhì)粒的鑒定

圖2重組菌的菌落PCR鑒定

還原及非還原型SDS-PAGE均可見相對(duì)分子質(zhì)量約27500目的蛋白條帶，但后者還出現(xiàn)相對(duì)分子質(zhì)量約55000的二聚體蛋白條帶，見圖4。表明二硫鍵可能負(fù)責(zé)嵌合HBc二聚體的形成，證實(shí)HBc-E1/2在MS中表達(dá)成功。圖3重組質(zhì)粒pMV261-HBc-E1/2的雙酶切（Pst....

圖3重組質(zhì)粒pMV261-HBc-E1/2的雙酶切（PstⅠ/HindⅢ）鑒定

圖2重組菌的菌落PCR鑒定圖4重組MS表達(dá)產(chǎn)物的還原型（A）及非還原型（B)SDS-PAGE分析

圖4重組MS表達(dá)產(chǎn)物的還原型（A）及非還原型（B)SDS-PAGE分析

圖3重組質(zhì)粒pMV261-HBc-E1/2的雙酶切（PstⅠ/HindⅢ）鑒定2.3.2Westernblot檢測(cè)

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