本文關(guān)鍵詞：幽門螺桿菌cag致病島hp0521基因功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:hp0521基因是I型H.pylori攜帶的cag致病島中2號基因,目前國內(nèi)外對其研究僅僅停留于序列多樣性及對Cag A轉(zhuǎn)運(yùn)和IL-8的影響。本實(shí)驗(yàn)針對H.pylori hp0521基因的多樣性和功能,從生物信息學(xué)、分子生物學(xué)等方面研究其在H.pylori致病機(jī)制中的作用。方法:1.對H.pylori NCTC11637及臨床菌株hp0521基因和cag A基因3,端可變區(qū)PCR擴(kuò)增,測序。使用生物信息學(xué)軟件分析hp0521基因基本理化性質(zhì)、系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建等方面,同時探討hp0521基因型與cag A可變區(qū)序列之間聯(lián)系。2.依據(jù)HP菌株OM6004 hp0521基因,體外合成菌株26695補(bǔ)全兩個堿基后CDS(coding sequence),構(gòu)建表達(dá)載體p ET-32a-hpc0521和p ET-32a-hp0521,Western Blot分析IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白。3.分析H.pylori 26695和NCTC11637 hp0521基因序列抗原決定簇,合成具有強(qiáng)抗原性的多肽并免疫獲得抗體,測效價。4.Western Blot驗(yàn)證HP菌株26695中hp0521基因編碼的Cag2蛋白表達(dá)情況。5.構(gòu)建p Blue KM40-(35)hp0521::kan自殺質(zhì)粒,電擊轉(zhuǎn)化,抗性篩選,PCR及測序驗(yàn)證,獲得缺失株△hp0521。6.測定相應(yīng)時間點(diǎn)的OD值,比較野生株26695和缺失株△hp0521生長情況。7.提取野生株26695和缺失株△hp0521總RNA,逆轉(zhuǎn)錄,PCR法比較下游基因hp0522、hp0523極化情況。8.網(wǎng)站預(yù)測及文獻(xiàn)查找hp0521互作基因,設(shè)計RT-PCR引物,比較其在m RNA水平上變化。9.Western Blot驗(yàn)證野生株26695和缺失株△hp0521中其他重要cag PAI編碼蛋白的穩(wěn)定性。10.進(jìn)行HP與細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),探討Cag A轉(zhuǎn)運(yùn)和IL-8分泌兩者與hp0521基因缺失的關(guān)系。結(jié)果:1.獲得HP菌株hp0521基因和cag A基因3,端可變區(qū)序列;hp0521基因編碼理化性質(zhì)穩(wěn)定且無信號肽的Cag2蛋白,結(jié)構(gòu)元件以無規(guī)則卷曲和α螺旋為主;Cag2蛋白與DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I同源,有介導(dǎo)細(xì)胞壁延伸等蛋白標(biāo)簽;進(jìn)化樹分析分別獲得其同源菌株。2.成功合成H.pylori 26695補(bǔ)全堿基后的CDS;成功構(gòu)建原核表達(dá)載體p ET-32a-hpc0521和p ET-32a-hp0521;成功驗(yàn)證hpc0521基因轉(zhuǎn)錄翻譯Cag2蛋白。3.成功制備效價是1:2.56×105的兔抗Cag2蛋白多克隆抗體。4.用制備的抗體,Western Blot證明H.pylori菌株26695 hp0521基因在菌體內(nèi)不轉(zhuǎn)錄翻譯為Cag2蛋白。5.成功構(gòu)建自殺質(zhì)粒p Blue KM40-(35)hp0521::kan;成功電轉(zhuǎn)化獲得缺失株:(35)hp0521。6.繪制野生株26695和缺失株△hp0521生長曲線,確定hp0521基因不影響菌株生長情況。7.確定hp0521基因缺失后不影響hp0522、hp0523基因轉(zhuǎn)錄。8.獲得hp0521互作基因?yàn)閔p0116、hp0333、hp0440、hp0515、hp0516、hp0520、hp0792、hp1293、hp1324、rpo B、cag A、vac A、ure A、fla B,經(jīng)RT-PCR確定hp0521基因缺失后cag A、rpo B的m RNA水平上調(diào)。9.hp0521基因缺失后,cag PAI編碼的Cag A蛋白表達(dá)量增加,Cag X、Cag M、Cag L、Cag S、Cag I、Cag V、Cagζ蛋白穩(wěn)定性無影響。10.與GES-1共培養(yǎng),缺失hp0521基因后Cag A轉(zhuǎn)運(yùn)和IL-8誘導(dǎo)無明顯變化。結(jié)論:1.通過克隆、測序及分析了解HP菌株hp0521基因編碼的Cag2蛋白具有DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶功能區(qū),同時一般hp0521基因缺失的HP菌株cag A基因普遍攜帶EPIYA-D基序。2.H.pylori 26695 hp0521基因因缺失兩個堿基后終止密碼子提前導(dǎo)致其不編碼Cag2蛋白。3.hp0521基因缺失對H.pylori的生長、對其他cag PAI編碼蛋白的穩(wěn)定性、對Cag A轉(zhuǎn)運(yùn)及IL-8誘導(dǎo)分泌無影響。4.hp0521基因可能與cag A、rpo B相互作用,且hp0521基因可能抑制Cag A蛋白的表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：幽門螺桿菌 cag致病島 hp0521 EPIYA-D CagA
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R378
【目錄】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-17
• 第一章 緒論17-24
• 1.1 研究背景17-22
• 1.1.1 H.pylori簡述17-18
• 1.1.2 H.pylori cag致病島研究現(xiàn)狀18-19
• 1.1.3 H.pylori CagA蛋白19-21
• 1.1.4 H.pylori hp0521基因21-22
• 1.2 本研究的目的、內(nèi)容及技術(shù)路線22-24
• 1.2.1 研究目的22
• 1.2.2 研究內(nèi)容22
• 1.2.3 技術(shù)路線22-24
• 第二章 H.pylori hp0521基因篩選及生物信息學(xué)分析24-45
• 2.1 材料24-27
• 2.1.1 臨床患者的篩選和標(biāo)本采集24
• 2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株和質(zhì)粒24-25
• 2.1.3 主要試劑25
• 2.1.4 主要溶液的配制25-26
• 2.1.5 主要儀器設(shè)備26
• 2.1.6 主要網(wǎng)站及相關(guān)分析軟件26-27
• 2.2 方法27-31
• 2.2.1 H.pylori的培養(yǎng)與鑒定27
• 2.2.2 H.pylori基因組DNA的抽提27
• 2.2.3 基因克隆引物的合成27-28
• 2.2.4 聚合酶鏈?zhǔn)剑≒CR）反應(yīng)28
• 2.2.5 包含目的基因的PCR片段回收28-29
• 2.2.6 感受態(tài)細(xì)菌細(xì)胞的制備29
• 2.2.7 T-A連接實(shí)驗(yàn)29-30
• 2.2.8 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化30
• 2.2.9 含目的基因大腸桿菌篩選鑒定30
• 2.2.10 目的基因序列測序分析30
• 2.2.11 生物信息學(xué)分析30-31
• 2.3 結(jié)果31-43
• 2.3.1 H.pylori分離、培養(yǎng)、鑒定31
• 2.3.2 基因PCR擴(kuò)增31-32
• 2.3.3 基因序列測序、分析、確定32-33
• 2.3.4 hp0521基因編碼Cag2蛋白的基本理化性質(zhì)分析33-34
• 2.3.5 Cag2蛋白二級結(jié)構(gòu)分析34-35
• 2.3.6 Cag2蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測35-36
• 2.3.7 hp0521基因編碼Cag2蛋白的信號肽預(yù)測36
• 2.3.8 Cag2蛋白跨膜區(qū)域預(yù)測36-38
• 2.3.9 Cag2蛋白功能結(jié)構(gòu)域分析38-39
• 2.3.10 Cag2蛋白質(zhì)指紋圖譜分析39-41
• 2.3.11 hp0521基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析41-42
• 2.3.12 hp0521基因與cagA基因 3，端可變區(qū)相關(guān)性分析42-43
• 2.4 討論43-45
• 第三章 H.pylori hp0521基因表達(dá)45-58
• 3.1 材料45-48
• 3.1.1 動物、菌株、質(zhì)粒和軟件45-46
• 3.1.2 主要試劑46
• 3.1.3 主要溶液配制46-48
• 3.1.4 主要儀器設(shè)備48
• 3.2 方法48-53
• 3.2.1 hp0521基因補(bǔ)全兩個堿基（hpc0521）的合成48-49
• 3.2.2 重組原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定49-50
• 3.2.3 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和全菌蛋白提取及Western Blot分析50-51
• 3.2.4 Cag2蛋白抗原表位分析51
• 3.2.5 Cag2多肽合成51
• 3.2.6 兔抗Cag2蛋白抗體的制備及效價測定51-52
• 3.2.7 標(biāo)準(zhǔn)H.pylori菌株全菌蛋白提取及Western Blot分析52-53
• 3.3 結(jié)果53-56
• 3.3.1 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-hp0521和pET32a-hpc0521的構(gòu)建53-54
• 3.3.2 重組表達(dá)質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)后蛋白提取及Western Blot分析54-55
• 3.3.3 Cag2多肽序列選擇及合成55
• 3.3.4 兔抗Cag2蛋白抗體效價測定55
• 3.3.5 抗Cag2蛋白抗體與H.pylori全菌蛋白Western Blot分析55-56
• 3.4 討論56-58
• 第四章 H.pylori hp0521基因缺失株構(gòu)建58-65
• 4.1 材料58-59
• 4.1.1 菌株、載體及軟件58
• 4.1.2 主要試劑58
• 4.1.3 主要溶液配制58
• 4.1.4 主要儀器58-59
• 4.2 方法59-61
• 4.2.1 細(xì)菌的培養(yǎng)59
• 4.2.2 hp0521基因上、下游同源臂的擴(kuò)增59
• 4.2.3 hp0521基因重組自殺質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定59-60
• 4.2.4 hp0521基因缺失株的構(gòu)建和鑒定60-61
• 4.3 結(jié)果61-63
• 4.3.1 hp0521基因上、下游同源臂的PCR擴(kuò)增61
• 4.3.2 hp0521基因缺失重組自殺質(zhì)粒的鑒定61-62
• 4.3.3 hp0521基因缺失株的鑒定62-63
• 4.4 討論63-65
• 第五章 hp0521基因功能初步探討65-77
• 5.1 材料65-66
• 5.1.1 菌株、細(xì)胞65
• 5.1.2 主要試劑65
• 5.1.3 主要溶液配制65
• 5.1.4 主要儀器65-66
• 5.1.5 主要網(wǎng)站及軟件66
• 5.2 方法66-70
• 5.2.1 H.pylori和細(xì)胞的培養(yǎng)66
• 5.2.2 H.pylori生長情況OD（光密度）值測定66
• 5.2.3 H.pylori總RNA的提取66-67
• 5.2.4 總RNA的逆轉(zhuǎn)錄67
• 5.2.5 H.pylori hp0521下游基因極化的影響67
• 5.2.6 與hp0521基因相互作用基因預(yù)測及RT-PCR引物設(shè)計67-69
• 5.2.7 hp0521基因與互作基因的熒光定量PCR69
• 5.2.8 H.pylori CagA蛋白表達(dá)量檢測69
• 5.2.9 hp0521基因缺失對其他重要cagPAI編碼蛋白穩(wěn)定性的影響69-70
• 5.2.10 hp0521基因缺失對CagA轉(zhuǎn)運(yùn)的影響70
• 5.2.11 hp0521基因缺失對誘導(dǎo)細(xì)胞分泌IL-8 的影響70
• 5.3 結(jié)果70-75
• 5.3.1 H.pylori生長曲線的繪制70-71
• 5.3.2 H.pylori hp0521下游基因極化影響的PCR驗(yàn)證71-72
• 5.3.3 hp0521基因與互作基因的熒光定量PCR驗(yàn)證72
• 5.3.4 H.pylori CagA蛋白表達(dá)影響72-73
• 5.3.5 hp0521基因缺失對cagPAI編碼的其他蛋白穩(wěn)定性影響73
• 5.3.6 hp0521基因缺失對CagA蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的影響73-74
• 5.3.7 hp0521基因缺失對IL-8 誘導(dǎo)分泌的影響74-75
• 5.4 討論75-77
• 第六章 主要結(jié)論及展望77-78
• 6.1 主要結(jié)論77
• 6.2 主要展望77-78
• 參考文獻(xiàn)78-85
• 致謝85-86
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文和參加的課題86

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本文編號：388853