角膜緣干細(xì)胞(LSCs)是一種可以被用來作為干細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)研究的理想材料。迄今為止,LSCs特異性標(biāo)志物仍未被確立。本文旨在以小鼠為實驗動物模型,利用免疫組化、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析,探究LSCs標(biāo)志物及其干性相關(guān)通路。本研究首先通過HE染色觀察角膜緣上皮組織學(xué)結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)了小鼠角膜緣上皮基底中并未存在Vogt氏柵狀皺紋(POV)結(jié)構(gòu),說明小鼠LSCs可能具有自己獨特的niche結(jié)構(gòu)。同時,利用角膜上皮細(xì)胞(CECs)、結(jié)膜上皮細(xì)胞和LSCs已知的可能標(biāo)志物,對小鼠的眼角膜組織進(jìn)行免疫組化染色,發(fā)現(xiàn)LSCs標(biāo)志物具有獨特的空間表達(dá)模式,并推測該結(jié)果與年齡因素相關(guān)。我們遂以出生前和出生后不同發(fā)育時間的小鼠角膜、角膜緣組織為樣品進(jìn)行HE染色和免疫組化染色。通過HE染色觀察,發(fā)現(xiàn)小鼠角膜發(fā)育早期以上皮下基質(zhì)發(fā)育為主,在P14眼瞼睜開后,光刺激促進(jìn)角膜上皮發(fā)育,轉(zhuǎn)為以角膜上皮發(fā)育為主,且在整個發(fā)育過程中也均未觀察到POV結(jié)構(gòu)。通過免疫組化染色觀察,發(fā)現(xiàn)LSCs標(biāo)志物在發(fā)育過程中呈動態(tài)表達(dá),按照其在發(fā)育過程中CECs表達(dá)減弱的時間先后順序排序如下:Vim>p63>CK15>C...

【文章頁數(shù)】：178 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
abstract
主要符號對照表
第1章 引言
    1.1 角膜上皮的動態(tài)穩(wěn)定
        1.1.1 角膜的組織學(xué)結(jié)構(gòu)和功能
        1.1.2 X/Y/Z假說
    1.2 LSCs及其niche
        1.2.1 LSCs的生物學(xué)特征
        1.2.2 LSC niche的結(jié)構(gòu)
        1.2.3 LSCs niche的組成
    1.3 LSCs標(biāo)志物研究現(xiàn)狀
        1.3.1 細(xì)胞周期調(diào)控蛋白
        1.3.2 ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白
        1.3.3 細(xì)胞骨架蛋白
        1.3.4 分化相關(guān)蛋白
    1.4 LSCs的識別
        1.4.1 LSCs標(biāo)記物共表達(dá)
        1.4.2 細(xì)胞核質(zhì)比大于0.7(N/C≥0.7)
        1.4.3 標(biāo)簽滯留
        1.4.4 側(cè)群現(xiàn)象
    1.5 LSCs特異性標(biāo)志物研究的難點
        1.5.1 角膜緣組織學(xué)的特殊性
        1.5.2 酶消化的影響
        1.5.3 缺乏理想的LSCs分離技術(shù)
        1.5.4 LSCs的時間和空間分布的影響
    1.6 新一代測序技術(shù)應(yīng)用于LSCs標(biāo)志物的研究
        1.6.1 轉(zhuǎn)錄組測序在LSCs標(biāo)志物的研究
        1.6.2 蛋白質(zhì)組測序在LSCs標(biāo)志物的研究
    1.7 本課題的來源與研究意義
    1.8 本課題的研究思路及主要研究內(nèi)容
第2章 小鼠角膜緣干細(xì)胞表達(dá)特點的研究
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗動物
        2.1.2 實驗試劑
        2.1.3 實驗儀器
    2.2 實驗方法
        2.2.1 組織收集
        2.2.2 石蠟切片制備
        2.2.3 HE染色
        2.2.4 免疫組化染色
    2.3 實驗結(jié)果
        2.3.1 小鼠眼球角膜的組織學(xué)結(jié)構(gòu)
        2.3.2 LSCs標(biāo)志物在小鼠眼球表面的空間表達(dá)分布
    2.4 分析與討論
        2.4.1 小鼠LSCs具有獨特的niche結(jié)構(gòu)
        2.4.2 4周齡小鼠LSCs的表達(dá)模式不同
    2.5 小結(jié)
第3章 小鼠角膜緣干細(xì)胞的基因表達(dá)與發(fā)育相關(guān)性的研究
    3.1 實驗材料
        3.1.1 實驗動物
        3.1.2 實驗試劑及耗材
        3.1.3 實驗儀器
    3.2 實驗方法
        3.2.1 組織收集
        3.2.2 蠟切片制備
        3.2.3 HE染色
        3.2.4 免疫組化染色
    3.3 實驗結(jié)果
        3.3.1 小鼠眼角膜的發(fā)育
        3.3.2 小鼠LSCs標(biāo)志物的表達(dá)與發(fā)育相關(guān)
    3.4 分析與討論
        3.4.1 光刺激促進(jìn)小鼠角膜上皮的發(fā)育
        3.4.2 LSCs的表達(dá)具有時間特性
    3.5 小結(jié)
第4章 基于Illumina平臺的小鼠角膜緣干細(xì)胞干性相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究
    4.1 實驗材料
        4.1.1 實驗動物
        4.1.2 實驗試劑和耗材
        4.1.3 實驗儀器
    4.2 實驗方法
        4.2.1 組織收集
        4.2.2 總RNA提取
        4.2.3 文庫制備以及Illumina Hiseq Xten測序
        4.2.4 轉(zhuǎn)錄組學(xué)序列的分析
        4.2.5 基因的表達(dá)以及功能分析
        4.2.6 qRT-PCR
        4.2.7 免疫組化染色
    4.3 實驗結(jié)果
        4.3.1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序概述
        4.3.2 樣品間基因表達(dá)相關(guān)性
        4.3.3 DEGs的識別
        4.3.4 DEGs的 GO分析
        4.3.5 DEGs的 KEGG通路富集
        4.3.6 DEGs的 qRT-PCR驗證
        4.3.7 細(xì)胞表面標(biāo)志物的免疫組化染色
    4.4 分析與討論
        4.4.1 潛在的LSCs標(biāo)志物表達(dá)的模式
        4.4.2 在LSCs中富集到的與發(fā)育和細(xì)胞命運相關(guān)的GO條目
        4.4.3 ECM相關(guān)的信號通路維持LSCs的表型
        4.4.4 LSCs的基因表達(dá)模式與細(xì)胞間交流有關(guān)
    4.5 小結(jié)
第5章 基于Label-Free LC-MS/MS的小鼠的角膜緣干細(xì)胞標(biāo)志物的研究
    5.1 實驗材料
        5.1.1 實驗動物
        5.1.2 實驗試劑和耗材
        5.1.3 實驗儀器
    5.2 實驗方法
        5.2.1 組織收集
        5.2.2 總蛋白提取和肽段酶解
        5.2.3 質(zhì)譜分析和LC-MS/MS數(shù)據(jù)采集
        5.2.4 DEPs的生物信息學(xué)分析
        5.2.5 免疫印跡檢測(WB)
        5.2.6 免疫組化染色
    5.3 實驗結(jié)果
        5.3.1 質(zhì)量控制以及鑒定蛋白質(zhì)和肽段的特性
        5.3.2 DEPs的識別
        5.3.3 DEPs的 GO分析
        5.3.4 DEPs的 KEGG通路富集
        5.3.5 免疫組化染色檢測候選LSCs標(biāo)志物
        5.3.6 DEPs的驗證
    5.4 分析與討論
        5.4.1 ALDH3B2、SLC5A8和HSD17B2 可作為候選LSCs標(biāo)志物
        5.4.2 細(xì)胞粘附蛋白維持LSCs表型及其niche細(xì)胞間的聯(lián)系
        5.4.3 Focal粘附信號通路調(diào)控LSCs增殖和自我更新
    5.5 小結(jié)
第6章 聯(lián)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析小鼠角膜緣干細(xì)胞干性相關(guān)通路
    6.1 實驗材料
    6.2 實驗方法
        6.2.1 技術(shù)路線
        6.2.2 關(guān)聯(lián)數(shù)量及其表達(dá)量相關(guān)性統(tǒng)計分析
        6.2.3 表達(dá)趨勢相同的DEGs和 DEPs的生物信息學(xué)分析
    6.3 實驗結(jié)果
        6.3.1 關(guān)聯(lián)數(shù)量統(tǒng)計
        6.3.2 表達(dá)量相關(guān)性分析
        6.3.3 關(guān)聯(lián)到的表達(dá)趨勢一致的DEPs的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析
        6.3.4 關(guān)聯(lián)到的表達(dá)趨勢一致的DEPs的GO分析
        6.3.5 關(guān)聯(lián)到的表達(dá)趨勢一致的DEPs的KEGG分析
    6.4 分析與討論
        6.4.1 細(xì)胞外外泌體參與CECs-LSCs的交流
        6.4.2 Focal粘附、ECM-受體相互作用和PI3K-AKT通路維持LSCs干性表型
    6.5 小結(jié)
第7章 總結(jié)與展望
    7.1 總結(jié)
    7.2 展望
參考文獻(xiàn)
致謝
附錄 A
附錄 B
個人簡歷、在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果



本文編號：3868008