角膜緣干細胞(LSCs)是一種可以被用來作為干細胞生物學基礎研究的理想材料。迄今為止,LSCs特異性標志物仍未被確立。本文旨在以小鼠為實驗動物模型,利用免疫組化、轉錄組學和蛋白質組學分析,探究LSCs標志物及其干性相關通路。本研究首先通過HE染色觀察角膜緣上皮組織學結構,發(fā)現了小鼠角膜緣上皮基底中并未存在Vogt氏柵狀皺紋(POV)結構,說明小鼠LSCs可能具有自己獨特的niche結構。同時,利用角膜上皮細胞(CECs)、結膜上皮細胞和LSCs已知的可能標志物,對小鼠的眼角膜組織進行免疫組化染色,發(fā)現LSCs標志物具有獨特的空間表達模式,并推測該結果與年齡因素相關。我們遂以出生前和出生后不同發(fā)育時間的小鼠角膜、角膜緣組織為樣品進行HE染色和免疫組化染色。通過HE染色觀察,發(fā)現小鼠角膜發(fā)育早期以上皮下基質發(fā)育為主,在P14眼瞼睜開后,光刺激促進角膜上皮發(fā)育,轉為以角膜上皮發(fā)育為主,且在整個發(fā)育過程中也均未觀察到POV結構。通過免疫組化染色觀察,發(fā)現LSCs標志物在發(fā)育過程中呈動態(tài)表達,按照其在發(fā)育過程中CECs表達減弱的時間先后順序排序如下:Vim>p63>CK15>C...

【文章頁數】：178 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
abstract
主要符號對照表
第1章 引言
    1.1 角膜上皮的動態(tài)穩(wěn)定
        1.1.1 角膜的組織學結構和功能
        1.1.2 X/Y/Z假說
    1.2 LSCs及其niche
        1.2.1 LSCs的生物學特征
        1.2.2 LSC niche的結構
        1.2.3 LSCs niche的組成
    1.3 LSCs標志物研究現狀
        1.3.1 細胞周期調控蛋白
        1.3.2 ATP結合轉運蛋白
        1.3.3 細胞骨架蛋白
        1.3.4 分化相關蛋白
    1.4 LSCs的識別
        1.4.1 LSCs標記物共表達
        1.4.2 細胞核質比大于0.7(N/C≥0.7)
        1.4.3 標簽滯留
        1.4.4 側群現象
    1.5 LSCs特異性標志物研究的難點
        1.5.1 角膜緣組織學的特殊性
        1.5.2 酶消化的影響
        1.5.3 缺乏理想的LSCs分離技術
        1.5.4 LSCs的時間和空間分布的影響
    1.6 新一代測序技術應用于LSCs標志物的研究
        1.6.1 轉錄組測序在LSCs標志物的研究
        1.6.2 蛋白質組測序在LSCs標志物的研究
    1.7 本課題的來源與研究意義
    1.8 本課題的研究思路及主要研究內容
第2章 小鼠角膜緣干細胞表達特點的研究
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗動物
        2.1.2 實驗試劑
        2.1.3 實驗儀器
    2.2 實驗方法
        2.2.1 組織收集
        2.2.2 石蠟切片制備
        2.2.3 HE染色
        2.2.4 免疫組化染色
    2.3 實驗結果
        2.3.1 小鼠眼球角膜的組織學結構
        2.3.2 LSCs標志物在小鼠眼球表面的空間表達分布
    2.4 分析與討論
        2.4.1 小鼠LSCs具有獨特的niche結構
        2.4.2 4周齡小鼠LSCs的表達模式不同
    2.5 小結
第3章 小鼠角膜緣干細胞的基因表達與發(fā)育相關性的研究
    3.1 實驗材料
        3.1.1 實驗動物
        3.1.2 實驗試劑及耗材
        3.1.3 實驗儀器
    3.2 實驗方法
        3.2.1 組織收集
        3.2.2 蠟切片制備
        3.2.3 HE染色
        3.2.4 免疫組化染色
    3.3 實驗結果
        3.3.1 小鼠眼角膜的發(fā)育
        3.3.2 小鼠LSCs標志物的表達與發(fā)育相關
    3.4 分析與討論
        3.4.1 光刺激促進小鼠角膜上皮的發(fā)育
        3.4.2 LSCs的表達具有時間特性
    3.5 小結
第4章 基于Illumina平臺的小鼠角膜緣干細胞干性相關基因的轉錄組學研究
    4.1 實驗材料
        4.1.1 實驗動物
        4.1.2 實驗試劑和耗材
        4.1.3 實驗儀器
    4.2 實驗方法
        4.2.1 組織收集
        4.2.2 總RNA提取
        4.2.3 文庫制備以及Illumina Hiseq Xten測序
        4.2.4 轉錄組學序列的分析
        4.2.5 基因的表達以及功能分析
        4.2.6 qRT-PCR
        4.2.7 免疫組化染色
    4.3 實驗結果
        4.3.1 轉錄組學測序概述
        4.3.2 樣品間基因表達相關性
        4.3.3 DEGs的識別
        4.3.4 DEGs的 GO分析
        4.3.5 DEGs的 KEGG通路富集
        4.3.6 DEGs的 qRT-PCR驗證
        4.3.7 細胞表面標志物的免疫組化染色
    4.4 分析與討論
        4.4.1 潛在的LSCs標志物表達的模式
        4.4.2 在LSCs中富集到的與發(fā)育和細胞命運相關的GO條目
        4.4.3 ECM相關的信號通路維持LSCs的表型
        4.4.4 LSCs的基因表達模式與細胞間交流有關
    4.5 小結
第5章 基于Label-Free LC-MS/MS的小鼠的角膜緣干細胞標志物的研究
    5.1 實驗材料
        5.1.1 實驗動物
        5.1.2 實驗試劑和耗材
        5.1.3 實驗儀器
    5.2 實驗方法
        5.2.1 組織收集
        5.2.2 總蛋白提取和肽段酶解
        5.2.3 質譜分析和LC-MS/MS數據采集
        5.2.4 DEPs的生物信息學分析
        5.2.5 免疫印跡檢測(WB)
        5.2.6 免疫組化染色
    5.3 實驗結果
        5.3.1 質量控制以及鑒定蛋白質和肽段的特性
        5.3.2 DEPs的識別
        5.3.3 DEPs的 GO分析
        5.3.4 DEPs的 KEGG通路富集
        5.3.5 免疫組化染色檢測候選LSCs標志物
        5.3.6 DEPs的驗證
    5.4 分析與討論
        5.4.1 ALDH3B2、SLC5A8和HSD17B2 可作為候選LSCs標志物
        5.4.2 細胞粘附蛋白維持LSCs表型及其niche細胞間的聯(lián)系
        5.4.3 Focal粘附信號通路調控LSCs增殖和自我更新
    5.5 小結
第6章 聯(lián)合轉錄組學和蛋白質組學分析小鼠角膜緣干細胞干性相關通路
    6.1 實驗材料
    6.2 實驗方法
        6.2.1 技術路線
        6.2.2 關聯(lián)數量及其表達量相關性統(tǒng)計分析
        6.2.3 表達趨勢相同的DEGs和 DEPs的生物信息學分析
    6.3 實驗結果
        6.3.1 關聯(lián)數量統(tǒng)計
        6.3.2 表達量相關性分析
        6.3.3 關聯(lián)到的表達趨勢一致的DEPs的蛋白互作網絡分析
        6.3.4 關聯(lián)到的表達趨勢一致的DEPs的GO分析
        6.3.5 關聯(lián)到的表達趨勢一致的DEPs的KEGG分析
    6.4 分析與討論
        6.4.1 細胞外外泌體參與CECs-LSCs的交流
        6.4.2 Focal粘附、ECM-受體相互作用和PI3K-AKT通路維持LSCs干性表型
    6.5 小結
第7章 總結與展望
    7.1 總結
    7.2 展望
參考文獻
致謝
附錄 A
附錄 B
個人簡歷、在學期間發(fā)表的學術論文與研究成果



本文編號：3868008