發(fā)布時(shí)間：2023-11-08 18:14

　　埃博拉病毒病(EVD)是由絲狀病毒科埃博拉病毒(EBOV)感染人類和非靈長(zhǎng)類動(dòng)物導(dǎo)致的致命性傳染性出血性疾病,病死率高。盡管目前針對(duì)EVD的研究和治療取得顯著進(jìn)步,但EBOV在宿主細(xì)胞內(nèi)的生命周期相關(guān)分子機(jī)制等仍不明確,可用于EVD患者的有效治療仍非常有限。本研究擬在2級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下,構(gòu)建具備復(fù)制和轉(zhuǎn)錄基本功能的埃博拉病毒樣顆粒(EBOV-trVLPs),合成靶向與RNA病毒生命周期(病毒入侵、脫殼、融合、復(fù)制、裝配及出芽等)密切相關(guān)的宿主siRNAs,通過(guò)RNA干擾(RNAi)來(lái)篩選對(duì)EBOV-trVLPs復(fù)制產(chǎn)生重要影響的宿主蛋白,并驗(yàn)證宿主蛋白與EBOV-trVLPs GP、VP40蛋白及核酸的相互作用關(guān)系。通過(guò)雜交瘤技術(shù)合成抗EBOVGP和VP40單克隆抗體(mAb),開(kāi)展體外抗EBOVGP和VP40 mAb單用及聯(lián)合應(yīng)用針對(duì)EBOV-trVLPs的抗病毒效應(yīng)研究。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)宿主分子伴侶、膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白等與EBOV-trVLPs生命周期密切相關(guān),并與trVLPs的GP、VP40蛋白及核酸發(fā)生相互作用;證實(shí)抗GP和抗VP40 mAb的聯(lián)合、抗VP40 ...

【文章頁(yè)數(shù)】：160 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
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縮略詞表
第一部分 埃博拉病毒樣顆粒體外復(fù)制系統(tǒng)的建立
    1.1 背景
    1.2 材料和方法
        1.2.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑和耗材
        1.2.2 細(xì)胞系和質(zhì)粒
        1.2.3 質(zhì)粒擴(kuò)增、抽提與鑒定
        1.2.4 trVLPs的構(gòu)建
        1.2.5 電鏡觀察trVLPs
        1.2.6 DiI標(biāo)記的trVLPs入侵活細(xì)胞過(guò)程觀察
        1.2.7 trVLPs的半數(shù)培養(yǎng)組織感染劑量(50% Tissue Culture Infective Dose,TCID50)測(cè)定
    1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        1.3.1 EBOV-trVLPs模型能在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中穩(wěn)定復(fù)制表達(dá)
        1.3.2 EBOV-trVLPs能在2級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室從大小和形態(tài)學(xué)上模擬EBOV野毒株
        1.3.3 DiI-trVLPs入侵活細(xì)胞過(guò)程示蹤
    1.4 討論
    1.5 參考文獻(xiàn)
第二部分 EBOV-trVLPs生命周期相關(guān)重要宿主因子的篩選及相互作用的研究
    2.1 背景
    2.2 材料和方法
        2.2.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑和耗材
        2.2.2 細(xì)胞系和質(zhì)粒
        2.2.3 SiRNAs庫(kù)的建立
        2.2.4 SiRNAs篩選流程
        2.2.5 RNAi與trVLPs感染
        2.2.6 RNA抽提及RT-PCR檢測(cè)siRNAs敲減后細(xì)胞內(nèi)trVLPs -RNA水平
        2.2.7 候選宿主蛋白抗體
        2.2.8 免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,CO-IP)及蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)
        2.2.9 染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,ChIP)
        2.2.10 數(shù)據(jù)分析
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 候選宿主蛋白與trVLPs-GP相互作用
        2.3.2 候選宿主蛋白與trVLPs-VP40相互作用
        2.3.3 候選宿主蛋白與trVLPs核酸相互作用
    2.4 討論
    2.5 參考文獻(xiàn)
第三部分 抗埃博拉病毒GP和VP40單克隆抗體的抗病毒效應(yīng)研究
    3.1 背景
    3.2 材料和方法
        3.2.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑和耗材
        3.2.2 抗EBOV-GP和VP40單克隆抗體
        3.2.3 細(xì)胞和質(zhì)粒
        3.2.4 trVLPs包裝、檢測(cè)
        3.2.5 RT-PCR驗(yàn)證GP及VP40-mAbs體外抗trVLPs效應(yīng)
        3.2.6 蛋白免疫印跡驗(yàn)證GP及VP40-mAbs體外抗trVLPs效應(yīng)
        3.2.7 細(xì)胞原位免疫熒光分析GP及VP40-mAbs抗trVLPs效應(yīng)
        3.2.8 抗體可變域測(cè)序
        3.2.9 數(shù)據(jù)分析
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 抗GP和抗VP40抗體具備抗trVLPs效應(yīng)
        3.3.2 抗GP和抗VP40抗體、抗VP40抗體之間的聯(lián)合(抗體的雞尾酒療法)具有協(xié)同抗病毒效應(yīng)
        3.3.3 抗體測(cè)序
    3.4 討論
    3.5 參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
附錄
個(gè)人簡(jiǎn)歷及攻讀博士學(xué)位期間所取得的科研成果



本文編號(hào)：3861485