發(fā)布時間：2023-07-01 12:38

　　mTOR信號通路在真核細(xì)胞代謝調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用,該通路核心元件mTORC1復(fù)合物的活性受其上游TSC復(fù)合物負(fù)調(diào)控,TSC復(fù)合物包括TSC1、TSC2、TBC1D7三種蛋白.以TBC1D7蛋白為研究對象,通過氨基酸序列比對顯示多物種來源的TBC1D7蛋白具有較高的保守性,且蛋白三維結(jié)構(gòu)分析證實其分子表面存在高度保守區(qū)域.隨后,構(gòu)建了人類TBC1D7蛋白原核表達(dá)載體并在大腸桿菌中表達(dá)得到全長TBC1D7蛋白,經(jīng)過酶切去除標(biāo)簽和凝膠排阻層析得到了高純度TBC1D7蛋白.另一方面,通過在HCM細(xì)胞中對TBC1D7進(jìn)行敲降和過表達(dá),證實了TBC1D7的表達(dá)會直接升高mTORC1的活性;反之,升高TBC1D7的表達(dá)則會抑制mTORC1的活性.本研究表達(dá)和純化了人類TBC1D7蛋白,并探討了在人類心肌細(xì)胞中TBC1D7的表達(dá)與其下游mTOR信號通路之間的聯(lián)系,為人類TBC1D7蛋白和mTOR信號通路的進(jìn)一步研究打下了良好基礎(chǔ).

【文章頁數(shù)】：10 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 試劑與引物
    1.2 菌株、細(xì)胞和質(zhì)粒
    1.3 序列保守性分析及進(jìn)化樹構(gòu)建
    1.4 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
    1.5 蛋白的原核表達(dá)
    1.6 Ni2+-NTA親和層析
    1.7 凝血酶酶切去除組氨酸標(biāo)簽
    1.8 凝膠排阻層析
    1.9 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染
    1.10 定量PCR
    1.11 免疫沉淀及免疫印跡
    1.12 蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)分析
2 結(jié)果與分析
    2.1 氨基酸序列保守性分析
    2.2 人類TBC1D7蛋白分子表面殘基保守性及電勢能分析
    2.3 TBC1D7的克隆與表達(dá)
    2.4 TBC1D7蛋白的純化
    2.5 TBC1D7的過表達(dá)和敲降
    2.6 TBC1D7表達(dá)水平的改變對mTORC1活性的影響
    2.7 TBC1D7與mTOR信號通路蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡(luò)分析
3 討論



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