阿爾茨海默病(Alzheimers disease,AD)是一種發(fā)生在人類老年階段的持續(xù)性高級(jí)神經(jīng)功能活動(dòng)障礙的原發(fā)性退行性腦病。其病理變化主要表現(xiàn)為大腦皮質(zhì)層的萎縮,同時(shí)并伴有β-淀粉樣蛋白(β-amyloid,Aβ)沉積和神經(jīng)元纖維纏結(jié)(Neurofibrillary tangles,NFT),記憶性神經(jīng)元變性壞死及數(shù)目大量減少,以致老年斑(Senile plaque,SP)的形成。Aβ蛋白在大腦皮質(zhì)細(xì)胞外間隙和腦血管壁中的沉積是AD神經(jīng)病理學(xué)的標(biāo)志。目前,AD的發(fā)病機(jī)制和藥物研發(fā)方面取得了良好的進(jìn)展,特別是針對(duì)Aββ寡聚體的影像學(xué)診斷已成為AD治療極具效果的手段。本試驗(yàn)研究用Aβ寡聚體免疫雙峰駝,分離外周血淋巴細(xì)胞,通過RT-PCR技術(shù),得到重鏈抗體的可變區(qū)(VHH),成功構(gòu)建了庫容為1×107的初級(jí)Aβ單域抗體庫。然后再以噬菌體展示技術(shù)對(duì)抗體庫進(jìn)行篩選,利用ELISA法篩選特異性識(shí)別Aβ寡聚體的陽性克隆株,在Transetta-DE3感受態(tài)細(xì)胞中加入Aβ連接pET-25b-SBP,在進(jìn)行可溶性表達(dá)和蛋白純化。SDS-PAGE分析結(jié)果顯示Aβ抗體以可溶性的形式獲得了正確的表達(dá),且...

【文章頁數(shù)】：50 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語表
1 引言
    1.1 阿爾茨海默病概述
        1.1.1 致病機(jī)理
        1.1.2 臨床癥狀
        1.1.3 診斷與預(yù)防
        1.1.4 國內(nèi)外AD免疫治療的研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢
    1.2 抗體概述
        1.2.1 抗體結(jié)構(gòu)
        1.2.2 單域抗體
    1.3 噬菌體展示技術(shù)與噬菌體抗體庫
        1.3.1 噬菌體展示技術(shù)
        1.3.2 噬菌體抗體庫的篩選
        1.3.3 噬菌體抗體庫技術(shù)展望
    1.4 研究目的及意義
2 試驗(yàn)一 抗Aβ寡聚體單域抗體庫構(gòu)建
    2.1 試驗(yàn)材料
        2.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物
        2.1.2 Aβ_1-42肽
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 培養(yǎng)基和緩沖液的配制
        2.1.5 試驗(yàn)儀器和設(shè)備
        2.1.6 PCR引物
    2.2 試驗(yàn)方法
        2.2.1 駱駝的免疫
        2.2.2 血清抗體效價(jià)的測定
        2.2.3 采集駱駝全血
        2.2.4 外周血淋巴細(xì)胞分離
        2.2.5 總RNA提取
        2.2.6 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA
        2.2.7 單域抗體基因的擴(kuò)增
        2.2.8 VHH片段的酶切
        2.2.9 pCANTAB5e載體的制備
        2.2.10 VHH片段與pCANTAB5e載體連接
        2.2.11 電轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TG1
        2.2.12 抗體庫的初步鑒定
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 血清抗體效價(jià)ELISA鑒定結(jié)果
        2.3.2 Aβ單域抗體基因的擴(kuò)增結(jié)果
        2.3.3 pCANTAB5e質(zhì)粒酶切結(jié)果
        2.3.4 抗體庫的鑒定
    2.4 討論
3 試驗(yàn)二 Aβ特異性單域抗體的富集和篩選
    3.1 試驗(yàn)材料
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑
        3.1.2 主要培養(yǎng)基和緩沖液配制方法
    3.2 試驗(yàn)方法
        3.2.1 Aβ單域抗體的富集和篩選
        3.2.2 Phage ELISA鑒定陽性克隆
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 輔助噬菌體M13K07復(fù)壯滴度結(jié)果
        3.3.2 Aβ特異性單域抗體的富集和篩選結(jié)果
        3.3.3 重組噬菌體單域抗體ELISA鑒定結(jié)果
    3.4 討論
4 試驗(yàn)三 Aβ特應(yīng)性單域抗體的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及鑒定
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 Aβ單域抗體
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 培養(yǎng)基和緩沖液的配制
    4.2 試驗(yàn)方法
        4.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.2.2 Aβ單域抗體的表達(dá)及純化
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 Aβ單域抗體基因擴(kuò)增結(jié)果
        4.3.2 表達(dá)質(zhì)粒和表達(dá)載體質(zhì)粒的酶切結(jié)果
        4.3.3 重組質(zhì)粒菌落鑒定結(jié)果
        4.3.4 菌體破碎SDS-PAGE結(jié)果
        4.3.5 菌體破碎ELISA結(jié)果
        4.3.6 純化蛋白SDS-PAGE結(jié)果
        4.3.7 純化蛋白ELISA檢測結(jié)果
    4.4 討論
5 結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
作者簡介



本文編號(hào)：3769355