阿爾茨海默病(Alzheimers disease,AD)是一種發(fā)生在人類老年階段的持續(xù)性高級神經(jīng)功能活動障礙的原發(fā)性退行性腦病。其病理變化主要表現(xiàn)為大腦皮質(zhì)層的萎縮,同時并伴有β-淀粉樣蛋白(β-amyloid,Aβ)沉積和神經(jīng)元纖維纏結(Neurofibrillary tangles,NFT),記憶性神經(jīng)元變性壞死及數(shù)目大量減少,以致老年斑(Senile plaque,SP)的形成。Aβ蛋白在大腦皮質(zhì)細胞外間隙和腦血管壁中的沉積是AD神經(jīng)病理學的標志。目前,AD的發(fā)病機制和藥物研發(fā)方面取得了良好的進展,特別是針對Aββ寡聚體的影像學診斷已成為AD治療極具效果的手段。本試驗研究用Aβ寡聚體免疫雙峰駝,分離外周血淋巴細胞,通過RT-PCR技術,得到重鏈抗體的可變區(qū)(VHH),成功構建了庫容為1×107的初級Aβ單域抗體庫。然后再以噬菌體展示技術對抗體庫進行篩選,利用ELISA法篩選特異性識別Aβ寡聚體的陽性克隆株,在Transetta-DE3感受態(tài)細胞中加入Aβ連接pET-25b-SBP,在進行可溶性表達和蛋白純化。SDS-PAGE分析結果顯示Aβ抗體以可溶性的形式獲得了正確的表達,且...

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語表
1 引言
    1.1 阿爾茨海默病概述
        1.1.1 致病機理
        1.1.2 臨床癥狀
        1.1.3 診斷與預防
        1.1.4 國內(nèi)外AD免疫治療的研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢
    1.2 抗體概述
        1.2.1 抗體結構
        1.2.2 單域抗體
    1.3 噬菌體展示技術與噬菌體抗體庫
        1.3.1 噬菌體展示技術
        1.3.2 噬菌體抗體庫的篩選
        1.3.3 噬菌體抗體庫技術展望
    1.4 研究目的及意義
2 試驗一 抗Aβ寡聚體單域抗體庫構建
    2.1 試驗材料
        2.1.1 試驗動物
        2.1.2 Aβ_1-42肽
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 培養(yǎng)基和緩沖液的配制
        2.1.5 試驗儀器和設備
        2.1.6 PCR引物
    2.2 試驗方法
        2.2.1 駱駝的免疫
        2.2.2 血清抗體效價的測定
        2.2.3 采集駱駝全血
        2.2.4 外周血淋巴細胞分離
        2.2.5 總RNA提取
        2.2.6 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA
        2.2.7 單域抗體基因的擴增
        2.2.8 VHH片段的酶切
        2.2.9 pCANTAB5e載體的制備
        2.2.10 VHH片段與pCANTAB5e載體連接
        2.2.11 電轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TG1
        2.2.12 抗體庫的初步鑒定
    2.3 結果
        2.3.1 血清抗體效價ELISA鑒定結果
        2.3.2 Aβ單域抗體基因的擴增結果
        2.3.3 pCANTAB5e質(zhì)粒酶切結果
        2.3.4 抗體庫的鑒定
    2.4 討論
3 試驗二 Aβ特異性單域抗體的富集和篩選
    3.1 試驗材料
        3.1.1 實驗試劑
        3.1.2 主要培養(yǎng)基和緩沖液配制方法
    3.2 試驗方法
        3.2.1 Aβ單域抗體的富集和篩選
        3.2.2 Phage ELISA鑒定陽性克隆
    3.3 結果
        3.3.1 輔助噬菌體M13K07復壯滴度結果
        3.3.2 Aβ特異性單域抗體的富集和篩選結果
        3.3.3 重組噬菌體單域抗體ELISA鑒定結果
    3.4 討論
4 試驗三 Aβ特應性單域抗體的誘導表達、純化及鑒定
    4.1 實驗材料
        4.1.1 Aβ單域抗體
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 培養(yǎng)基和緩沖液的配制
    4.2 試驗方法
        4.2.1 重組質(zhì)粒的構建
        4.2.2 Aβ單域抗體的表達及純化
    4.3 結果
        4.3.1 Aβ單域抗體基因擴增結果
        4.3.2 表達質(zhì)粒和表達載體質(zhì)粒的酶切結果
        4.3.3 重組質(zhì)粒菌落鑒定結果
        4.3.4 菌體破碎SDS-PAGE結果
        4.3.5 菌體破碎ELISA結果
        4.3.6 純化蛋白SDS-PAGE結果
        4.3.7 純化蛋白ELISA檢測結果
    4.4 討論
5 結論
致謝
參考文獻
作者簡介



本文編號：3769355