結核分枝桿菌氨酰tRNA合成酶催化機制研究
發(fā)布時間：2023-03-11 02:41
結核病(TB)是由結核分枝桿菌引起的嚴重感染性疾病,是全球十大死因之一。據(jù)WHO的報告,2016年全球有1,040萬人患有結核病。其中,兒童感染者為100萬。170萬人死于該病(其中40萬人患有艾滋病毒)。抗生素在結核病治療中的長期使用,引起耐藥結核菌感染病例增多。2016年,世界范圍內估計新增60萬例多重耐藥結核菌感染病例,為結核病的防治工作帶來前所未有的嚴峻挑戰(zhàn)。因此,發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點和設計新型抗結核藥物迫在眉睫。氨酰tRNA合成酶(aminoacyl-tRNAsynthetases,aaRS)作為細胞內高度保守蛋白酶家族,參與到生物遺傳信息翻譯過程中,負責將氨基酸轉移到對應的tRNA上,是確保細胞內遺傳信息忠實翻譯的酶。根據(jù)結構與模序(motif)的差異,aaRS被分為兩類,每一類由10種酶組成。在所有的20種氨酰tRNA合成酶中,MetRS的生物學作用最為重要。它不僅識別初始tRNA,同時參與蛋白質肽鏈的延伸。除此之外,不同物種來源的MetRS具有結構上的多樣性。在近幾年的aaRS抑制劑研究中,發(fā)現(xiàn)了一些氨酰tRNA合成酶抑制劑,具有高選擇性和強抑制能力。aaRS已被證明是理想...
【文章頁數(shù)】：105 頁
【學位級別】：博士
【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
引言
1 氨酰tRNA合成酶在生命中的功能
2 氨酰tRNA合成酶的進化
3 氨酰tRNA合成酶抑制劑的研究現(xiàn)狀
4 甲硫氨酰tRNA合成酶研究現(xiàn)狀
本課題擬解決的科學問題
本課題研究內容和意義
1 重組蛋白的獲得和生化研究
2 結核分枝桿菌MetRS的晶體學研究
3 結核分枝桿菌MetRS的結構分析及突變驗證
第一章 結核分枝桿菌MetRS重組蛋白質的制備和生化研究
1.1 材料與儀器
1.1.1 材料
1.1.2 儀器
1.2 方法
1.2.1 MetRS氨基酸序列分析
1.2.2 MetRS基因的克隆
1.2.3 MetRS重組蛋白的表達篩選
1.2.4 MetRS重組蛋白的純化
1.2.5 重組蛋白質的活性測定
1.2.6 MetRS酶反應動力學分析
1.3 結果
1.3.1 MetRS的多序列比對及聚類分析
1.3.2 結核分枝桿菌MetRS重組表達載體的構建篩選
1.3.3 結核分枝桿菌MetRS重組蛋白的制備
1.3.4 結核分枝桿菌MetRS重組蛋白質的活性鑒定
1.3.5 底物甲硫氨酸Km常數(shù)
1.3.6 底物ATP Km常數(shù)
1.3.7 MetRS酶反應動力學比較
1.4 討論
第二章 結核分枝桿菌MetRS晶體學研究
2.1 材料與儀器
2.2 方法
2.2.1 MetRS配體選擇
2.2.2 晶體生長條件篩選
2.2.3 晶體生長條件優(yōu)化
2.2.4 晶體的凍存條件優(yōu)化
2.2.5 晶體數(shù)據(jù)收集
2.2.6 晶體數(shù)據(jù)處理和結構的解析
2.3 結果
2.3.1 FTS實驗結果
2.3.2 Unligend MtMetRS結晶及衍射
2.3.3 MtMetRS:Met-AMP復合物結晶及衍射
2.3.4 衍射數(shù)據(jù)的處理及結構優(yōu)化
2.4 討論
第三章 結核分枝桿菌MetRS結構分析及驗證
3.1 材料與儀器
3.2 方法
3.2.1 MtMetRS結構分析
3.2.2 MetRS分子模型分析
3.2.3 突變體實驗
3.3 結果
3.3.1 不同物種MetRS的比較
3.3.2 MtMetRS整體結構模型
3.3.3 底物誘導的MetRS構象變化
3.3.4 MetRS結合中間產物的差異
3.3.5 MetRS保守性分析
3.3.6 MetRS核酸結合環(huán)的穩(wěn)定性分析
3.3.7 MtMetRS疏水表面分析
3.3.8 突變實驗分析
3.4 討論
結論
參考文獻
附錄 縮略詞表
致謝
個人簡歷及發(fā)表文章
本文編號：3759037
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1 氨酰tRNA合成酶在生命中的功能
2 氨酰tRNA合成酶的進化
3 氨酰tRNA合成酶抑制劑的研究現(xiàn)狀
4 甲硫氨酰tRNA合成酶研究現(xiàn)狀
本課題擬解決的科學問題
本課題研究內容和意義
1 重組蛋白的獲得和生化研究
2 結核分枝桿菌MetRS的晶體學研究
3 結核分枝桿菌MetRS的結構分析及突變驗證
第一章 結核分枝桿菌MetRS重組蛋白質的制備和生化研究
1.1 材料與儀器
1.1.1 材料
1.1.2 儀器
1.2 方法
1.2.1 MetRS氨基酸序列分析
1.2.2 MetRS基因的克隆
1.2.3 MetRS重組蛋白的表達篩選
1.2.4 MetRS重組蛋白的純化
1.2.5 重組蛋白質的活性測定
1.2.6 MetRS酶反應動力學分析
1.3 結果
1.3.1 MetRS的多序列比對及聚類分析
1.3.2 結核分枝桿菌MetRS重組表達載體的構建篩選
1.3.3 結核分枝桿菌MetRS重組蛋白的制備
1.3.4 結核分枝桿菌MetRS重組蛋白質的活性鑒定
1.3.5 底物甲硫氨酸Km常數(shù)
1.3.6 底物ATP Km常數(shù)
1.3.7 MetRS酶反應動力學比較
1.4 討論
第二章 結核分枝桿菌MetRS晶體學研究
2.1 材料與儀器
2.2 方法
2.2.1 MetRS配體選擇
2.2.2 晶體生長條件篩選
2.2.3 晶體生長條件優(yōu)化
2.2.4 晶體的凍存條件優(yōu)化
2.2.5 晶體數(shù)據(jù)收集
2.2.6 晶體數(shù)據(jù)處理和結構的解析
2.3 結果
2.3.1 FTS實驗結果
2.3.2 Unligend MtMetRS結晶及衍射
2.3.3 MtMetRS:Met-AMP復合物結晶及衍射
2.3.4 衍射數(shù)據(jù)的處理及結構優(yōu)化
2.4 討論
第三章 結核分枝桿菌MetRS結構分析及驗證
3.1 材料與儀器
3.2 方法
3.2.1 MtMetRS結構分析
3.2.2 MetRS分子模型分析
3.2.3 突變體實驗
3.3 結果
3.3.1 不同物種MetRS的比較
3.3.2 MtMetRS整體結構模型
3.3.3 底物誘導的MetRS構象變化
3.3.4 MetRS結合中間產物的差異
3.3.5 MetRS保守性分析
3.3.6 MetRS核酸結合環(huán)的穩(wěn)定性分析
3.3.7 MtMetRS疏水表面分析
3.3.8 突變實驗分析
3.4 討論
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