目的:用同源重組的方法構(gòu)建大鼠甘油二酯激酶γ(DGKγ)慢病毒過表達(dá)載體,為進(jìn)一步研究DGKγ在神經(jīng)上皮細(xì)胞的作用機(jī)制提供實(shí)驗基礎(chǔ)。方法:提取成年SD大鼠腦組織總RNA,以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板,通過PCR反應(yīng)分別擴(kuò)增大鼠DGKγ基因CDS區(qū)5’端1029bp和3’端1362bp作為同源重組片段,片段一和片段二之間有24bp重疊序列,設(shè)計引物時在片段一上游引物的5’端和片段二下游引物的5’端分別引入15-25bp與線性化載體末端相同的堿基序列;限制性內(nèi)切酶酶切穿梭質(zhì)粒使線性化,利用同源重組技術(shù)將擴(kuò)增得到的兩個同源重組片段與線性化載體進(jìn)行定向連接,重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞,用氨芐青霉素篩選陽性單克隆,進(jìn)行菌液培養(yǎng);隨機(jī)選取兩個陽性單克隆的菌液,提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物送測序鑒定,鑒定正確的質(zhì)粒命名為CMV-rat DGKγ-GFP;將CMV-rat DGKγ-GFP慢病毒質(zhì)粒載體與慢病毒包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,包裝產(chǎn)生慢病毒,以CMV-GFP空載體作為對照;收集慢病毒毒液感染293T細(xì)胞,熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞中GFP的表達(dá),用嘌呤霉素篩選GFP陽性細(xì)胞,收集細(xì)胞應(yīng)用實(shí)時熒...

【文章頁數(shù)】：37 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
前言
1 材料與方法
    1.1 材料
    1.2 方法
        1.2.1 目的片段擴(kuò)增
        1.2.2 穿梭質(zhì)粒構(gòu)建
        1.2.3 293T細(xì)胞培養(yǎng)
        1.2.4 慢病毒包裝
        1.2.5 慢病毒感染
        1.2.6 熒光定量PCR
        1.2.7 細(xì)胞蛋白的提取
        1.2.8 Western blotting
        1.2.9 統(tǒng)計方法
2 結(jié)果
    2.1 大鼠DGKγ基因CDS區(qū)和兩個同源重組片段的擴(kuò)增
    2.2 CMV-rat DGKγ-GFP載體構(gòu)建
    2.3 CMV-rat DGKγ-GFP載體慢病毒包裝
    2.4 慢病毒CMV-rat DGKγ-GFP在293T細(xì)胞中的表達(dá)
3 討論
4 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
綜述 同源重組技術(shù)構(gòu)建載體的研究
    參考文獻(xiàn)
致謝
個人簡歷



本文編號：3750217