發(fā)布時(shí)間：2017-05-16 13:25

  本文關(guān)鍵詞：惡性瘧原蟲exosome-like催化亞基的鑒定與降解特性分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：真核生物外切體是一種進(jìn)化保守的多亞基核酸外切酶復(fù)合體,一般由10-11個(gè)不同的蛋白亞基組成。它是真核生物中重要的3'→5'核糖核酸外切酶之一,參與了生物體內(nèi)多種RNA分子的3'端加工和降解,對(duì)于生物體的正常生長發(fā)育和調(diào)控具有重要作用。惡性瘧原蟲屬于原生生物,是惡性瘧疾的病原體,給人類的健康帶來極大的危害。然而目前關(guān)于惡性瘧原蟲RNA加工降解機(jī)制研究較少,更未見惡性瘧原蟲外切體的相關(guān)研究報(bào)道。這可能影響了人們對(duì)惡性瘧原蟲應(yīng)對(duì)復(fù)雜生活史和宿主免疫壓力的作用機(jī)制的全面解析。通過對(duì)惡性瘧原蟲3D7株蛋白質(zhì)組進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),在惡性瘧原蟲中可能也存在著一種類似外切復(fù)合體(exosome-like),該復(fù)合體至少由8個(gè)不同的亞基組成。結(jié)合功能域分析和其他研究報(bào)道篩選出四個(gè)催化亞基分別為Pf Rrp4、Pf Rrp41、Pf Dis3、和Pf Rrp6,同時(shí)選取Pf Rrp42亞基作為對(duì)照。以惡性瘧原蟲3D7株為研究對(duì)象,首先以絲氨酰t RNA合成酶基因作為內(nèi)參基因,通過熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各亞基在蟲體紅內(nèi)期的轉(zhuǎn)錄差異。通過構(gòu)建重組表達(dá)載體,在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中分別表達(dá)純化His-tag和GST-tag重組蛋白質(zhì)。其中His-tag重組蛋白質(zhì)用來免疫新西蘭家兔制備多克隆抗體。然后通過Western blot和間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)對(duì)蟲體中天然蛋白質(zhì)的表達(dá)和定位進(jìn)行分析。而純化得到的GST-tag重組蛋白質(zhì)則用于各亞基的體外RNA降解特性分析。熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)表明惡性瘧原蟲exosome-like催化亞基在紅內(nèi)期轉(zhuǎn)錄差異較大,但各亞基在紅內(nèi)期全程轉(zhuǎn)錄平穩(wěn),這說明各亞基對(duì)于蟲體的生長發(fā)育必不可少。Western blot和間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示各亞基在蟲體內(nèi)均為全長表達(dá),且均表達(dá)于蟲體的細(xì)胞質(zhì)中,臨近于核膜的周圍。體外RNA降解實(shí)驗(yàn)表明Pf Rrp41、Pf Dis3和Pf Rrp6亞基均具有單鏈RNA酶活性,而Pf Rr4和Pf Rrp42亞基對(duì)單、雙鏈RNA均無降解能力。在降解單鏈RNA時(shí),Pf Rrp41、Pf Dis3和Pf Rrp6的催化活性均為二價(jià)金屬離子依賴性,且在一定金屬離子濃度范圍內(nèi),其降解活性與離子濃度成反比。不同的是,Pf Rrp41亞基在降解單鏈RNA時(shí)不需要鉀離子的參與,而Pf Dis3和Pf Rrp6的催化活性還具有鉀離子依賴性,且在100 m M鉀離子濃度時(shí)達(dá)到活性高峰。通過本研究表明,在惡性瘧原蟲中也存在一種exosome-like多亞基復(fù)合體,參與蟲體RNA的加工和降解。該復(fù)合體的Pf Rrp41、Pf Dis3和Pf Rrp6三個(gè)亞基為催化亞基,具有單鏈RNA酶活性,且均表達(dá)于蟲體細(xì)胞質(zhì)中。這將為進(jìn)一步解析蟲體外切體的結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ),為解析蟲體內(nèi)RNA分子的加工降解機(jī)制提供新的視野。
【關(guān)鍵詞】：惡性瘧原蟲 exosome-like 催化亞基 RNA降解
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R382.31
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 英文縮寫詞表10-11
• 引言11-13
• 第一篇 文獻(xiàn)綜述13-22
• 第1章 真核生物外切體概述13-22
• 1 真核生物外切體的組成與結(jié)構(gòu)13-19
• 1.1 外切體核心結(jié)構(gòu)Exo914-16
• 1.2 RRP44/Dis3亞基16-17
• 1.3 RRP6亞基17
• 1.4 真核生物外切體的亞基同系物及其存在形式17-19
• 2 真核生物外切體的功能19-22
• 第二篇 研究內(nèi)容22-71
• 第1章 生物信息學(xué)分析22-30
• 1.1 材料22-23
• 1.2 方法23-24
• 1.3 結(jié)果24-27
• 1.4 討論27-28
• 1.5 小結(jié)28-30
• 第2章 熒光定量PCR檢測(cè)目的催化亞基在惡性瘧原蟲 3D7株紅內(nèi)期的轉(zhuǎn)錄差異30-38
• 2.1 材料30-32
• 2.2 方法32-35
• 2.3 結(jié)果35-36
• 2.4 討論36-37
• 2.5 小結(jié)37-38
• 第3章 惡性瘧原蟲exosome-like催化亞基重組蛋白質(zhì)的原核表達(dá)、純化以及多克隆抗體的制備38-57
• 3.1 材料38-42
• 3.2 方法42-49
• 3.3 結(jié)果49-55
• 3.4 討論55-56
• 3.5 小結(jié)56-57
• 第4章 目的亞基的天然蛋白質(zhì)鑒定與亞細(xì)胞定位分析57-63
• 4.1 材料57-58
• 4.2 方法58-59
• 4.3 結(jié)果59-61
• 4.4 討論61-62
• 4.5 小結(jié)62-63
• 第5章 惡性瘧原蟲exosome-like催化亞基的體外RNA降解特性分析63-71
• 5.1 材料63-64
• 5.2 方法64-66
• 5.3 結(jié)果66-69
• 5.4 討論69-70
• 5.5 小結(jié)70-71
• 結(jié)論71-72
• 參考文獻(xiàn)72-79
• 攻讀碩士期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文79-80
• 導(dǎo)師簡(jiǎn)介80-81
• 作者簡(jiǎn)介81-82
• 致謝82

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