目的:制備與鑒定抗GRP78兔多克隆抗體與腹水型單克隆抗體,進(jìn)一步建立可檢測(cè)GRP78蛋白的雙抗夾心ELISA方法。方法:利用課題組前期已經(jīng)成功構(gòu)建的pW28-GRP78重組質(zhì)粒,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后經(jīng)過(guò)Ni²⁺-NTA親和層析柱分離純化獲得高純度GRP78重組蛋白;獲得的GRP78蛋白免疫新西蘭兔制備多克隆抗體,辛酸-硫酸銨沉淀后DEAE離子交換層析法純化;制備GRP78腹水型單克隆抗體并鑒定其亞型,Protein G親合柱純化;采用Western blot、免疫熒光、免疫組化等方法對(duì)獲得的GRP78兔多抗與鼠單抗進(jìn)行鑒定;建立一個(gè)可檢測(cè)GRP78蛋白的雙抗夾心ELISA免疫學(xué)方法。結(jié)果:高效獲得高純度GRP78重組蛋白,成功制備兔多抗,同時(shí)獲取8株腹水型單克隆抗體,選擇效價(jià)最高的McAb-1用于后續(xù)雙抗夾心ELISA實(shí)驗(yàn),McAb-1為G2a型;進(jìn)一步的鑒定結(jié)果表明制備的抗體皆具有良好免疫反應(yīng)性及特異性;單抗作為捕獲抗體,多抗作為檢測(cè)抗體,HRP標(biāo)記的羊抗兔酶標(biāo)二抗,成功建立可檢測(cè)人GRP78的雙抗夾心ELISA方法,檢測(cè)下限為152.3 ng/mL。結(jié)論:成功... 

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【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
    1.2 方法
        1.2.1 GRP78蛋白的表達(dá)與純化
            1.2.1. 1 GRP78蛋白表達(dá)
            1.2.1. 2 GRP78蛋白純化
        1.2.2 抗GRP78多克隆抗體制備與純化
        1.2.3 抗GRP78腹水型單克隆抗體制備與純化
            1.2.3. 1 抗GRP78腹水型單克隆抗體的制備
            1.2.3. 2 抗GRP78腹水型單克隆抗體的純化
        1.2.4 雙抗夾心ELISA法檢測(cè)系統(tǒng)的建立
        1.2.5 封閉條件及羊抗兔酶標(biāo)二抗作用時(shí)間優(yōu)化
        1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及靈敏度的確定
        1.2.7 試劑盒的特異性檢測(cè)
        1.2.8 回收率實(shí)驗(yàn)
        1.2.9 雙夾心ELISA法的可重復(fù)性檢測(cè)
2 結(jié)果
    2.1 GRP78重組蛋白原核表達(dá)純化
    2.2 抗GRP78兔多抗與腹水型鼠單抗制備純化
    2.3 抗GRP78抗體的鑒定
    2.4 雙抗夾心ELISA法檢測(cè)系統(tǒng)的建立
    2.5 雙抗夾心ELISA法的優(yōu)化
    2.6 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線
    2.7 試劑盒的特異性檢測(cè)
    2.8 可重復(fù)性檢測(cè)
    2.9 血清中GRP78蛋白添加回收率檢測(cè)
3 討論


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]幾種提純鴨病毒性肝炎血清免疫球蛋白G方法的比較[J]. 馬秀麗,馮濤,于可響,王春玲,宋敏訓(xùn).  山東農(nóng)業(yè)科學(xué). 2007(01)



本文編號(hào)：3646936