目的以慢病毒介導人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）基因轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人髓核細胞,建立永生化髓核細胞系,為后期轉(zhuǎn)基因與動物實驗提供種子細胞。方法利用機械與酶消化的方法獲得正常的人椎間盤髓核細胞,將構(gòu)建好的重組慢病毒-hTERT（pLVX-hTERT）轉(zhuǎn)染第2代體外單層培養(yǎng)的髓核細胞。用重組慢病毒-增強型綠色熒光蛋白作為標記物,在熒光電鏡下觀察細胞轉(zhuǎn)染效率,按感染復數(shù)（MOI）40、60、80、100設(shè)組,選擇出病毒轉(zhuǎn)染的最佳MOI;設(shè)立pLVX-hTERT轉(zhuǎn)染組、空病毒轉(zhuǎn)染對照組及空白細胞對照組。在倒置顯微鏡下觀察髓核細胞的形態(tài),用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)、細胞免疫熒光技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后hTERT基因在髓核細胞內(nèi)的表達情況,用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測髓核細胞Ⅱ型膠原及蛋白多糖的表達情況。結(jié)果慢病毒轉(zhuǎn)染細胞后第6天,MOI為100時轉(zhuǎn)染效率最高,可達82.9%。pLVX-hTERT轉(zhuǎn)染組在轉(zhuǎn)染后第7、15、30、60、90天均可檢測到hTERT基因的表達,而兩對照組則未見表達。pLVX-hTERT轉(zhuǎn)染組保持了髓核細胞的形態(tài),兩對照組的細胞則出現(xiàn)返祖現(xiàn)象。pLVX-hTERT轉(zhuǎn)染組細胞的蛋白多糖及Ⅱ型膠原基... 

【文章來源】：青島大學學報(醫(yī)學版). 2020,56(05)

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

同一視野下熒光電鏡及光鏡的髓核細胞觀察

RT-PCR檢測的結(jié)果顯示,pLVX-hTERT轉(zhuǎn)染組細胞的蛋白多糖及Ⅱ型膠原基因表達水平較兩對照組均明顯增高(F=173.5、111.1,P<0.05),而兩對照組之間差異則無顯著意義(P>0.05)。轉(zhuǎn)染第15天后,隨著hTERT基因的穩(wěn)定高表達,pLVX-hTERT轉(zhuǎn)染組髓核細胞中蛋白多糖及Ⅱ型膠原基因表達水平也達到較穩(wěn)定的高表達狀態(tài),各轉(zhuǎn)染組之間差異無顯著性(P>0.05)。見表2。表2 各組Ⅱ型膠原及蛋白多糖基因表達水平比較 ( n= 5, x ˉ ±s) 組別 Ⅱ型膠原 蛋白多糖 A組 0.327±0.061 0.153±0.003 B組 0.311±0.440 0.151±0.004 C組 第7天 0.468±0.008 0.218±0.011 第15天 0.533±0.011 0.278±0.015 第30天 0.528±0.010 0.276±0.009 第60天 0.526±0.013 0.271±0.015

【參考文獻】：
期刊論文
[1]重組腺相關(guān)病毒介導人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因轉(zhuǎn)染對人髓核細胞功能的影響[J]. 吳劍宏,阮狄克,王德利,張超,何勍,王超鋒,張燕,辛洪奎,顧韜,徐成,劉玥.  中國脊柱脊髓雜志. 2012(09)
[2]人正常椎間盤髓核細胞體外不同培養(yǎng)代次的生物學性狀分析:適應(yīng)于組織工程椎間盤種子細胞的選擇[J]. 葉冬平,梁偉國,戴麗冰,沈雁.  中國組織工程研究與臨床康復. 2010(24)
[3]端粒酶轉(zhuǎn)染大鼠胰島素分泌細胞建立的永生化細胞系[J]. 任甫,侯續(xù)偉,徐國昌,尹波.  中國組織工程研究與臨床康復. 2009(33)
[4]Mechanisms of cell immortalization mediated by EB viral activation of telomerase in nasopharyngeal carcinoma[J]. LucyCassar,AlexPinto.  Cell Research. 2006(10)
[5]椎間盤細胞培養(yǎng)過程中的反分化研究[J]. 陳巖,胡有谷,劉勇.  中國脊柱脊髓雜志. 2000(03)



本文編號：3624607