人脂肪干細(xì)胞（ADSCs）的分離培養(yǎng)及多向分化潛能研究
發(fā)布時(shí)間：2022-01-09 20:10
本研究在標(biāo)準(zhǔn)化cGMP條件下從人體脂肪組織分離獲得脂肪干細(xì)胞（Adipose-derived Stem Cells,ADSCs）,并在無(wú)血清培養(yǎng)條件下大規(guī)模擴(kuò)增培養(yǎng),并對(duì)獲得的細(xì)胞質(zhì)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化鑒定及功能驗(yàn)證。建立無(wú)分化、大規(guī)模擴(kuò)增培養(yǎng),預(yù)期形成一套國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)體系。在密閉運(yùn)輸脂肪抽吸物至實(shí)驗(yàn)室,實(shí)驗(yàn)中采用酶消化法及差速離心方法分離得到基質(zhì)血管分離段（Stromal Vascular Fraction,SVF）,差速貼壁方法純化ADSCs,并在所配制的無(wú)血清培養(yǎng)基中擴(kuò)增培養(yǎng)。采用流式檢測(cè)鑒定脂肪干細(xì)胞（ADSCs）表面標(biāo)記物。取第三代ADSCs細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板之內(nèi),用含有脂肪分化、成骨分化和軟骨分化誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基中分別進(jìn)行誘導(dǎo)分化2-3周時(shí)間,并分別用2%油紅染色劑、茜素紅染色劑及用阿利新藍(lán)冰醋酸染色劑分別染色鑒定其細(xì)胞分化狀況。在實(shí)驗(yàn)中我們分離純化所得到的細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)條件下穩(wěn)定培養(yǎng)至10代以上時(shí)并無(wú)出現(xiàn)分化現(xiàn)象,細(xì)胞形態(tài)呈細(xì)、短、小梭形、細(xì)胞飽滿、大小均一且漩渦狀生長(zhǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)密度為5000/cm2時(shí),倍增時(shí)間為20-25 h,細(xì)胞直徑范圍在16-20μm時(shí)...
【文章來(lái)源】：內(nèi)蒙古大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū) 211工程院校
【文章頁(yè)數(shù)】：51 頁(yè)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【部分圖文】：
脂肪來(lái)源干細(xì)胞（ADSCs）的獲得、分離和鑒定過(guò)程示意圖
5 分鐘，離心，棄上清；入 100μL buffer I 工作液，逐管加入對(duì)應(yīng)熒光抗體，渦漩振 min；并上流式細(xì)胞儀檢測(cè) ADSCs 細(xì)胞表面標(biāo)記物；2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.3.1 脂肪細(xì)胞的分離的人來(lái)源脂肪組織置于超凈工作臺(tái)，在無(wú)菌環(huán)境下分裝于 50 m及用 0.5%Ⅰ型膠原酶及 0.25% 胰蛋白酶共同消化下，分離得到條件下，震蕩 30 min，1 h，并采用密度梯度離心方法得到 SVF，擴(kuò)增培養(yǎng)做準(zhǔn)備。AB
2.3.2 脂肪干細(xì)胞原代細(xì)胞培養(yǎng)及體外擴(kuò)增密度梯度離心及酶消化法分離得到 SVF，差速貼壁方法分離提純 ADSCs 細(xì)胞。如圖代數(shù)的增加，ADSCs 純度變高，在無(wú)血清培養(yǎng)條件下成功建立了原代培養(yǎng)體系，具、高純度、穩(wěn)定可重復(fù)性及安全性的原代脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)體系。分離培養(yǎng)獲得的群中無(wú)纖維母細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞，無(wú)絮狀物。鏡下動(dòng)態(tài)觀察：脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)后的第一天，少量細(xì)胞貼壁，細(xì)胞呈圓形；第三天梭形，且細(xì)胞體積比 P1 代細(xì)胞大，排列方向不均勻；隨著代數(shù)的增加，ADSC 體積排列方向規(guī)則，呈現(xiàn)出螺旋狀生長(zhǎng)。隨著代數(shù)的增加，細(xì)胞未呈現(xiàn)出形態(tài)差異；在期間，每隔三天傳一次代，按照 5000/cm2細(xì)胞密度接種，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到 80%-傳代。
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞成軟骨分化的研究進(jìn)展[J]. 紀(jì)曉琳,王慷慨,王念. 中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版). 2019(02)
[2]A familiar stranger:CD34 expression and putative functions in SVF cells of adipose tissue[J]. Arnaud Scherberich,Nunzia Di Maggio,Kelly M McNagny. World Journal of Stem Cells. 2013(01)
[3]富血小板血漿對(duì)體外培養(yǎng)人脂肪來(lái)源干細(xì)胞增殖及成脂分化的作用[J]. 張?jiān)扑?何井華,肖冠英,黎慶梅. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào). 2011(03)
本文編號(hào)：3579365
【文章來(lái)源】：內(nèi)蒙古大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū) 211工程院校
【文章頁(yè)數(shù)】：51 頁(yè)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【部分圖文】：
脂肪來(lái)源干細(xì)胞（ADSCs）的獲得、分離和鑒定過(guò)程示意圖
5 分鐘，離心，棄上清；入 100μL buffer I 工作液，逐管加入對(duì)應(yīng)熒光抗體，渦漩振 min；并上流式細(xì)胞儀檢測(cè) ADSCs 細(xì)胞表面標(biāo)記物；2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.3.1 脂肪細(xì)胞的分離的人來(lái)源脂肪組織置于超凈工作臺(tái)，在無(wú)菌環(huán)境下分裝于 50 m及用 0.5%Ⅰ型膠原酶及 0.25% 胰蛋白酶共同消化下，分離得到條件下，震蕩 30 min，1 h，并采用密度梯度離心方法得到 SVF，擴(kuò)增培養(yǎng)做準(zhǔn)備。AB
2.3.2 脂肪干細(xì)胞原代細(xì)胞培養(yǎng)及體外擴(kuò)增密度梯度離心及酶消化法分離得到 SVF，差速貼壁方法分離提純 ADSCs 細(xì)胞。如圖代數(shù)的增加，ADSCs 純度變高，在無(wú)血清培養(yǎng)條件下成功建立了原代培養(yǎng)體系，具、高純度、穩(wěn)定可重復(fù)性及安全性的原代脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)體系。分離培養(yǎng)獲得的群中無(wú)纖維母細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞，無(wú)絮狀物。鏡下動(dòng)態(tài)觀察：脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)后的第一天，少量細(xì)胞貼壁，細(xì)胞呈圓形；第三天梭形，且細(xì)胞體積比 P1 代細(xì)胞大，排列方向不均勻；隨著代數(shù)的增加，ADSC 體積排列方向規(guī)則，呈現(xiàn)出螺旋狀生長(zhǎng)。隨著代數(shù)的增加，細(xì)胞未呈現(xiàn)出形態(tài)差異；在期間，每隔三天傳一次代，按照 5000/cm2細(xì)胞密度接種，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到 80%-傳代。
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞成軟骨分化的研究進(jìn)展[J]. 紀(jì)曉琳,王慷慨,王念. 中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版). 2019(02)
[2]A familiar stranger:CD34 expression and putative functions in SVF cells of adipose tissue[J]. Arnaud Scherberich,Nunzia Di Maggio,Kelly M McNagny. World Journal of Stem Cells. 2013(01)
[3]富血小板血漿對(duì)體外培養(yǎng)人脂肪來(lái)源干細(xì)胞增殖及成脂分化的作用[J]. 張?jiān)扑?何井華,肖冠英,黎慶梅. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào). 2011(03)
本文編號(hào)：3579365
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