為了實(shí)現(xiàn)在體外制備巨細(xì)胞病毒-免疫球蛋白M（CMV-IgM）和探討不同信號肽對CMV-IgM表達(dá)的影響,通過RLM-RACE技術(shù)釣取雜交瘤細(xì)胞基因序列,構(gòu)建人鼠嵌合CMV-IgM表達(dá)載體,并通過PCR方法將5種不同的分泌型信號肽（SigA–SigE）代替CMV-IgM自身信號肽（SigF）,利用中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO）作為宿主細(xì)胞進(jìn)行體外表達(dá)。對純化后的CMV-IgM進(jìn)行SDS-PAGE、SEC-HPLC和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）確定其蛋白表達(dá)水平與免疫反應(yīng)性,最終成功制備出910 kDa的重組蛋白,且研究表明,5種信號肽（SigA–SigE）的人鼠嵌合CMV-IgM表達(dá)量較CMV 6#細(xì)胞株自身信號肽SigF相比,分別提高了6.72、5.19、1.44、1.85、1.98倍。這將對人鼠嵌合CMV-IgM的開發(fā)提供理論基礎(chǔ),且為提高CMV-IgM表達(dá)量的研究工作提供了新思路。 

【文章來源】：生物工程學(xué)報(bào). 2020,36(06)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：9 頁

【部分圖文】：

人鼠嵌合CMV-IgM真核表達(dá)載體的構(gòu)建

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，隔天開始監(jiān)測細(xì)胞密度與存活率(圖3A–B)，結(jié)果顯示：人鼠嵌合CMV-IgM轉(zhuǎn)染Expi CHO細(xì)胞后，第1天細(xì)胞密度達(dá)到高峰期(9.6×106 cells/mL)，隨后細(xì)胞密度與存活率均開始逐步下降，第9天收獲目的蛋白。經(jīng)Protein L柱純化后，根據(jù)蛋白純度換算其表達(dá)量，結(jié)果表明：在本研究6種信號肽比較中，A信號肽引導(dǎo)CMV-IgM分泌的能力最強(qiáng)，自身信號肽F引導(dǎo)目的蛋白分泌的能力最弱，表達(dá)量最高相差6.72倍(圖3C)。圖3 細(xì)胞狀態(tài)與蛋白表達(dá)(A：活細(xì)胞密度；B：細(xì)胞存活率；C：各自信號肽分泌蛋白的表達(dá)量，n=3)

細(xì)胞狀態(tài)與蛋白表達(dá)(A：活細(xì)胞密度；B：細(xì)胞存活率；C：各自信號肽分泌蛋白的表達(dá)量，n=3)


本文編號：3559839