本文關(guān)鍵詞：訶子提取物HZ4對腦梗死模型的作用及藥理學(xué)機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：腦梗死及后遺癥屬于嚴重威脅人類健康的重大疾病,發(fā)病率較高。腦梗死后遺癥發(fā)病機制復(fù)雜,臨床上缺乏理想的治療方法及藥物。近年來,干細胞療法為腦梗死后遺癥患者帶來了希望。神經(jīng)干細胞(neural stem cell, NSCs)起源于多潛能干細胞,具有自我更新以及多分化潛能,最新研究表明,激活內(nèi)源性NSCs增殖分化可以促進腦功能重塑,對腦梗后神經(jīng)系統(tǒng)的功能恢復(fù)具有巨大的潛能,成為當前治療腦梗死后遺癥的重要方向。訶子作為一種傳統(tǒng)民族藥物,在中醫(yī)及少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中有著悠久的應(yīng)用歷史,被稱為“藏藥之王”。現(xiàn)代研究顯示,訶子具有神經(jīng)保護和細胞保護作用,具有重要的臨床應(yīng)用價值。訶子含有多種神經(jīng)保護及促進神經(jīng)功能康復(fù)的活性成分,為治療腦梗死后遺癥提供了可能,值得深入研究。本實驗室在2009年利用正丁醇、乙酸乙酯和乙醇提取等步驟獲得了一種訶子乙醇提取物(HZ4),并初步發(fā)現(xiàn)其具有較好的神經(jīng)保護和促NSCs增殖活性。為了研究HZ4治療腦梗死后遺癥的作用效果以及探討可能的分子機制,本實驗分別從整體動物水平和細胞水平進行藥理學(xué)研究,為HZ4治療腦梗死后遺癥的應(yīng)用潛力提供實驗依據(jù)。方法：1.雄性健康的SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、三七總皂苷陽性對照組、HZ4高、中、低劑量組。采用光化學(xué)法建立大鼠局灶性腦梗死模型。利用平衡木實驗、足失誤實驗和雙邊觸覺膠去除實驗等行為學(xué)測定方法來研究HZ4對腦梗死后大鼠神經(jīng)功能缺失的影響；同時,通過檢測腦梗死體積、腦組織病理變化、血腦屏障通透性以及血清LDH的含量研究了HZ4對腦組織的保護作用；測定了大鼠血清中T-AOC、SOD及MDA的變化,研究了HZ4對腦梗死大鼠血清的抗氧化能力；采用免疫組織化學(xué)法檢測了腦梗死后NSCs的標志蛋白Nestin的表達變化情況,并利用RT-PCR技術(shù)檢測了Wnt和Notch信號通路中P-catenin、Cyclin D1、Notchl和Hes1在內(nèi)的四個關(guān)鍵節(jié)點基因的表達變化,研究HZ4對腦梗死大鼠模型可能的作用分子機制。2,半懸浮培養(yǎng)法體外培養(yǎng)大鼠大腦皮層NSCs,并利用免疫熒光法鑒定NSCs的生物特性；建立NSCs氧糖剝奪復(fù)供模型(OGD/R),并將實驗分為正常對照組、模型組、三七總皂苷陽性對照組、HZ4高、中、低劑量組。采用CCK-8法測定NSCs的細胞活力,研究HZ4對NSCs的保護作用；同時利用RT-PCR技術(shù)測定β-catenin、Cyclin D1、Notchl和Hes1四個關(guān)鍵節(jié)點基因的表達變化,研究HZ4對NSCs增殖影響的可能分子機制。結(jié)果：1.HZ4對腦梗死大鼠腦組織具有明顯保護作用：與假手術(shù)組相比,模型組大鼠出現(xiàn)嚴重的神經(jīng)功能缺失現(xiàn)象,病灶周邊處病理表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)疏松且細胞排列紊亂、核固縮等,大腦出現(xiàn)明顯梗死現(xiàn)象(P0.01),并且血腦屏障的通透性破壞,血清抗氧化能力明顯下降(P0.01)。與模型組相比,給藥組大鼠神經(jīng)功能損傷程度及病理變化得到明顯的改善,大鼠的梗死體積和血腦屏障通透性得到顯著地減少(P0.05),同時發(fā)現(xiàn)血清抗氧化能力也有所提高。2.HZ4促進了腦梗死大鼠內(nèi)源性NSCs和體外OGD/R損傷的NSCs增殖活性：與假手術(shù)組相比,腦梗死損傷可以明顯上調(diào)NSCs的標志性蛋白Nestin的含量(P0.01)；而各給藥組大鼠內(nèi)源性NSCs增殖能力明顯提高,腦組織內(nèi)Nestin蛋白的含量較模型組顯著增多(P0.05)。體外實驗發(fā)現(xiàn),與正常對照組相比,經(jīng)過OGD/R損傷的NSCs的細胞活力明顯下降(P0.01)；而各給藥組NSCs的細胞活力明顯優(yōu)于模型組(P0.05)。3.HZ4對腦梗死大鼠腦組織和體外OGD/R損傷的NSCs Wnt和Notch信號通路相關(guān)基因表達的影響：大鼠腦梗死給藥7 d后,與模型組相比,給藥組Wnt和Notch信號通路中β-catenin、Cyclin D1、Notchl和Hes1四個關(guān)鍵節(jié)點基因的表達均明顯地上調(diào)(P0.05)。同時,在體外實驗中, Wnt和Notch信號通路中β-catenin、Cyclin D1、Notchl和Hes1四個關(guān)鍵節(jié)點基因的表達上調(diào)變化得到證實。結(jié)論：本實驗在整體水平和細胞水平發(fā)現(xiàn)訶子提取物HZ4具有明顯的神經(jīng)保護作用,可以改善模型動物的神經(jīng)行為學(xué)功能,并且這種作用與其調(diào)控Wnt和Notch兩條信號通路,促進內(nèi)源性NSCs增殖有關(guān)。本研究首次證實HZ4激活Wnnt和Notch兩條信號通路,形成一個生物網(wǎng)絡(luò)進而調(diào)控NSCs的增殖,有一定的創(chuàng)新性。
【關(guān)鍵詞】：HZ4 局灶性腦梗死 神經(jīng)干細胞 增殖 Wnt信號通路 Notch信號通路
【學(xué)位授予單位】：中央民族大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R29;R-332
【目錄】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-19
• 英文縮略詞表19-20
• 第一章 前言20-28
• 第一節(jié) 腦梗死的病理及治療研究現(xiàn)狀20-23
• 一、腦梗死概述20
• 二、腦梗死后遺癥的治療策略20-23
• 1. 治療腦梗死的常用方法概況21
• 2. 應(yīng)用神經(jīng)干細胞治療腦梗死21-23
• 第二節(jié) 神經(jīng)干細胞增殖的主要分子信號通路研究進展23-27
• 一、Wnt信號通路及其對NSCs增殖的調(diào)控作用23-24
• 二、Notch信號通路及其對NSCs增殖的調(diào)控作用24-25
• 三、基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)理論分析NSCs增殖的網(wǎng)絡(luò)機制25-27
• 第三節(jié) 訶子的活性研究27-28
• 第二章 整體水平研究HZ4對腦梗死的藥效作用及其分子機制28-62
• 第一節(jié) 實驗材料28-31
• 一、實驗動物28
• 二、主要實驗儀器及器材28
• 三、主要實驗試劑28-30
• 四、主要溶液的配制30-31
• 第二節(jié) 實驗方法31-43
• 一、成年大鼠局灶性腦梗死模型的建立31-32
• 二、分組與給藥32-33
• 三、行為學(xué)研究方法33-35
• 1. 平衡木實驗方法33-34
• 2. 足失誤實驗方法34-35
• 3. 雙邊觸覺膠去除實驗方法35
• 四、腦組織病理學(xué)研究方法35
• 五、TTC染色法測定大鼠腦梗死體積35-36
• 六、大鼠血腦屏障通透性檢測方法36
• 七、明膠酶譜法測定MMP-9蛋白的含量36-39
• 八、大鼠血清生化指標的測定方法39-40
• 九、免疫組化技術(shù)檢測Nestin蛋白的表達40
• 十、RT-PCR技術(shù)檢測Wnt和Notch通路中關(guān)鍵基因的表達40-43
• 十一、數(shù)據(jù)處理43
• 第三節(jié) 實驗結(jié)果43-58
• 一、實驗大鼠的體重變化及一般生存情況43
• 二、行為學(xué)研究結(jié)果43-45
• 1. 平衡木實驗結(jié)果43-44
• 2. 足失誤實驗結(jié)果44
• 3. 雙邊觸覺膠去除實驗結(jié)果44-45
• 三、HZ4對腦組織缺血區(qū)的保護作用45-50
• 1. 病理學(xué)研究結(jié)果45-46
• 2. HZ4對模型大鼠腦梗死體積的影響46-48
• 3. HZ4對血腦屏障的影響48-50
• 四、HZ4對血清LDH、T-AOC、SOD和MDA的影響50-52
• 五、腦組織Nestin免疫組織化學(xué)染色結(jié)果52-53
• 六、Wnt和Notch通路中關(guān)鍵基因的表達變化53-58
• 1. 提取的總RNA純度檢測結(jié)果53
• 2. 提取的總RNA完整性檢測結(jié)果53-54
• 3. HZ4對腦梗死后β-catenin基因表達的影響54-55
• 4. HZ4對腦梗死后Cyclin D1基因表達的影響55-56
• 5. HZ4對腦梗死后Notch1基因表達的影響56-57
• 6. HZ4對腦梗死后Hes1基因表達的影響57-58
• 第四節(jié) 討論58-61
• 第五節(jié) 小結(jié)61-62
• 第三章 細胞水平初步研究HZ4促NSCs增殖作用62-77
• 第一節(jié) 實驗材料62-64
• 一、實驗動物62
• 二、主要實驗儀器及器材62
• 三、實驗試劑62-63
• 四、主要溶液配制63-64
• 第二節(jié) 實驗步驟64-68
• 一、神經(jīng)干細胞的分離與培養(yǎng)64
• 二、神經(jīng)干細胞的鑒定64-65
• 三、神經(jīng)干細胞氧糖剝奪復(fù)供(OGD/R)模型的制備65
• 四、分組與給藥65-66
• 五、神經(jīng)干細胞活力測定66
• 六、利用RT-PCR技術(shù)檢測關(guān)鍵節(jié)點基因的表達變化66-67
• 七、數(shù)據(jù)處理67-68
• 第三節(jié) 實驗結(jié)果68-74
• 一、神經(jīng)干細胞的形態(tài)學(xué)觀察及鑒定結(jié)果68
• 二、HZ4對OGD/R損傷后神經(jīng)干細胞形態(tài)的影響68-69
• 三、HZ4對OGD/R損傷后神經(jīng)干細胞的細胞活力的影響69-70
• 四、HZ4對Wnt和Notch通路中關(guān)鍵基因的表達影響70-74
• 1. 提取的總RNA純度和完整性檢測結(jié)果70-71
• 2. HZ4對OGD/R損傷NSCs后β-catenin基因的影響71
• 3. HZ4對OGD/R損傷NSCs后Cyclin D1基因的影響71-72
• 4. HZ4對OGD/R損傷NSCs后Notch1基因的影響72-73
• 5. HZ4對OGD/R損傷NSCs后Hes1基因的影響73-74
• 第四節(jié) 討論74-76
• 第五節(jié) 小結(jié)76-77
• 第四章 全文總結(jié)77-78
• 參考文獻78-85
• 致謝85-86
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)成果目錄86

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 陳小玉;莊述娟;劉慶山;;訶子神經(jīng)保護作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[J];時珍國醫(yī)國藥;2012年10期

  本文關(guān)鍵詞：訶子提取物HZ4對腦梗死模型的作用及藥理學(xué)機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：355968