背景和目的:手足口病近年來在我國(guó)和東南亞地區(qū)國(guó)家造成了數(shù)百萬的感染,導(dǎo)致嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。在我國(guó)呈高發(fā)趨勢(shì)的手足口病病原體是腸道病毒EV-71型和柯薩奇病毒CV-A16型。深入研究腸道病毒的基因組特點(diǎn)和進(jìn)化規(guī)律,將對(duì)手足口病的流行和防治起到至關(guān)重要的作用。雖然目前臨床診斷腸道病毒以檢測(cè)到病毒核酸為確診指標(biāo)之一,但只是確認(rèn)病毒的局部特征片段,并不能獲取全基因組序列,不能支持腸道病毒的深入研究,而對(duì)腸道病毒進(jìn)行基因組比較分析必須首先找到能夠擴(kuò)增我國(guó)腸道病毒流行株的引物。本研究通過調(diào)查近年來我國(guó)腸道病毒流行株的全基因組序列,建立一種能夠獲得我國(guó)腸道病毒序列的通用擴(kuò)增方法,為今后的手足口病流行病學(xué)分析、致病機(jī)理等打下基礎(chǔ)。方法:收集我國(guó)近五年各地報(bào)道的腸道病毒流行株全基因組序列作為參考序列,對(duì)參考序列進(jìn)行比對(duì)分析,在保守區(qū)設(shè)計(jì)通用引物,以本實(shí)驗(yàn)室保存的腸道病毒毒株對(duì)引物進(jìn)行篩選和驗(yàn)證。利用經(jīng)過優(yōu)化的3’RACE、長(zhǎng)距離PCR擴(kuò)增腸道病毒編碼區(qū)和3’UTR區(qū),利用簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增腸道病毒5’UTR區(qū),獲得腸道病毒的全基因組序列。使用Ion Torrent PGM二代測(cè)序儀對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行深度測(cè)序以對(duì)... 

【文章來源】：軍事科學(xué)院北京市

【文章頁(yè)數(shù)】：81 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

腸道病毒5‘UTR區(qū)532bp至568bp比對(duì)結(jié)果

腸道病毒5‘UTR區(qū)7bp至27bp比對(duì)結(jié)果

圖 1.3 P3U-T 引物逆轉(zhuǎn)錄腸道病毒 RNA 獲得腸道病毒全長(zhǎng)的 cDNA 產(chǎn)物 P3U-T 引物逆轉(zhuǎn)錄得到的 cDNA 為模板進(jìn)行長(zhǎng)距離 PCR 擴(kuò)增，驗(yàn) P3U-T2 引物的有效性。我們對(duì)上述引物的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電圖 1.4 顯示，DNA 電泳泳道從左至右依次是 Marker、HEV-96、H19、HEV-1376，可見 4 株腸道病毒均成功擴(kuò)增出長(zhǎng)度約 7000bp 左右特異性擴(kuò)增。該 DNA 電泳圖結(jié)果顯示 P3U-5 引物和 P3U-T2 引物病毒多聚蛋白編碼區(qū)和 3’ UTR 區(qū)序列，且擴(kuò)增的特異性較好。

【參考文獻(xiàn)】：
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博士論文
[1]腸道病毒71型基因分析、病毒拯救、毒力及免疫原性的比較研究[D]. 侯俊.中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院 2014



本文編號(hào)：3555933