發(fā)布時(shí)間：2017-05-10 05:13

  本文關(guān)鍵詞：抗菌肽Plectasin高效原核表達(dá)菌株的構(gòu)建及表達(dá)條件優(yōu)化的正交試驗(yàn)，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：[背景]隨著廣譜抗生素在臨床上的廣泛應(yīng)用,革蘭氏陽性球菌細(xì)菌耐藥性問題日益嚴(yán)峻,這增加了疾病治愈的難度并給患者和社會帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。細(xì)菌耐藥產(chǎn)生的原因是多方面的,其中抗菌藥物的廣泛使用和濫用最為主要�？股氐拈L期大量使用除了誘發(fā)細(xì)菌的廣泛耐藥之外,還會導(dǎo)致諸多不良反應(yīng)和毒副作用,如肝腎功能損害、血液和神經(jīng)系統(tǒng)毒性、胃腸道反應(yīng)等,這些不良反應(yīng)也同樣影響了敏感抗生素在治療耐藥革蘭陽性球菌感染中的選擇,因此開發(fā)新一代具有生物活性的抗菌物質(zhì)顯得尤為迫切和必要。抗菌肽是一種具有高效抗菌、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)功能的多肽,是動(dòng)物先天免疫的重要組成部分。研究表明：抗菌肽廣泛存在于各種生物體內(nèi),對細(xì)菌、真菌、病毒、原蟲甚至癌細(xì)胞都有不同程度的抑制和殺滅作用。與傳統(tǒng)抗生素相比,抗菌肽因作用機(jī)制獨(dú)特而不易產(chǎn)生耐藥性,部分抗菌肽還具備免疫調(diào)節(jié)活性。目前已有多種抗菌肽進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。美國Magainin公司開發(fā)的抗菌肽Pexiganan已成功應(yīng)用于臨床治療糖尿病足感染。2002年從腐生真菌中發(fā)現(xiàn)新型抗菌肽——菌絲霉素Plectasin,它對肺炎球菌、金黃色葡萄球菌及腸球菌,包括耐藥型的肺炎球菌和耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)都有良好的殺滅作用,且毒副作用非常小,這一發(fā)現(xiàn)顯示了Plectasin的強(qiáng)大的應(yīng)用潛力。生物體內(nèi)天然抗菌肽含量很低,直接分離純化步驟繁雜耗時(shí),而通過化學(xué)合成的方法大量生產(chǎn)抗菌肽則價(jià)格昂貴,因此,尋找一種更具成本效益的生產(chǎn)方法成為抗菌肽產(chǎn)業(yè)化的又一關(guān)鍵點(diǎn)。隨著生物技術(shù)的逐步成熟和市場的需要呈上升趨勢,重組抗菌肽成為多肽類藥物產(chǎn)業(yè)化的主要方向之一。目前,大多數(shù)抗菌肽由像大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)這樣的原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá),但使用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)Plectasin目前報(bào)道較少。原核表達(dá)系統(tǒng)直接表達(dá)抗菌肽存在以下問題：1、大多數(shù)抗菌肽對大腸桿菌有抗菌活性；2、大多數(shù)表達(dá)蛋白以包涵體的形式存在；3、大腸桿菌缺乏翻譯后修飾和加工功能；4、表達(dá)的蛋白容易被蛋白酶降解；針對上述問題,目前通常采用融合表達(dá)策略來解決,利用不同功能的分子伴侶與抗菌肽在大腸桿菌中進(jìn)行融合表達(dá)可以降低抗菌肽對宿主的毒害作用,提高表達(dá)蛋白可溶性和穩(wěn)定性,并且可以設(shè)計(jì)特定的裂解位點(diǎn)釋放抗菌肽。隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展,利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)抗菌肽不失為一種經(jīng)濟(jì)高效的方法。構(gòu)建高效重組大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)抗菌肽Plectasin,對表達(dá)的Plectasin進(jìn)行體外活性檢測,并對其表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化,對推動(dòng)針對耐藥革蘭陽性球菌感染的新型抗菌藥物——抗菌肽的研發(fā)具有積極意義。[目的]本實(shí)驗(yàn)擬選取硫氧還蛋白(TrxA)、小泛素相關(guān)修飾物(SUMO)、內(nèi)含肽(Intein2)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)四種不同的分子伴侶分別構(gòu)建重組大腸桿菌菌株Origami-pET-32a(+)-PS、Origami-pE-SUMO-PS、Origami-pTWIN1-C-P S、Origami-pGEX-5x-2-PS對抗菌肽Plecatsin融合表達(dá),綜合表達(dá)融合蛋白的可溶性、切割效率、Plectasin最終理論產(chǎn)量,篩選出合適的分子伴侶和高效的重組大腸桿菌菌株。利用實(shí)驗(yàn)中獲得Plectasin進(jìn)行體外抗菌活性實(shí)驗(yàn),觀察Plectasin對MRSA、耐萬古霉素腸球菌(VRE)、耐青霉素肺炎鏈球菌(PRSP)抗菌活性,測定Plectasin對不同細(xì)菌的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)。觀察Plectasin在不同pH和溫度條件下的活性和穩(wěn)定性。選取誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間三個(gè)因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn),對Plectasin原核表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化,探索Plectasin原核表達(dá)的合適條件。最終為Plectasin進(jìn)一步研究、生產(chǎn)及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。[方法]1抗菌肽Plectasin高效原核表達(dá)菌株的構(gòu)建1.1 Plectasin基因的修飾根據(jù)Mandal的研究獲得Plectasin氨基酸序列,基于大腸桿菌同義密碼子偏好性,設(shè)計(jì)優(yōu)化的Plectasin基因序列。Plectasin基因兩端分別添加相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶識別序列和切割酶識別序列。1.2重組質(zhì)粒的構(gòu)建和識別Plectasin修飾基因經(jīng)過相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶處理后,分別連接到經(jīng)過相同內(nèi)切酶處理過的質(zhì)粒構(gòu)成重組質(zhì)粒pGEX-5x-2-PS。Plectasin基因序列與TrxA、SUMO、Intein2、GST四種分子伴侶的基因序列分別進(jìn)行重組,構(gòu)建融合表達(dá)基因,分別被命名為1rxA-PS、SUMO-PS、Intein2-PS、GST-PS。四種重組質(zhì)粒分別被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α菌株用于質(zhì)粒擴(kuò)增。通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、雙酶切法和DNA測序確定重組質(zhì)粒成功構(gòu)建。1.3融合蛋白的測定重組質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Origami (DE3)菌株用于融合蛋白表達(dá)。經(jīng)誘導(dǎo)后,通過離心獲得菌株,用聲波降解法對菌株進(jìn)行破解并離心獲得上層清液及沉淀。使用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分別檢測經(jīng)誘導(dǎo)的全菌蛋白、未經(jīng)誘導(dǎo)的全菌蛋白、破菌離心上清液和破菌離心沉淀中融合蛋白表達(dá)情況,確定融合蛋白的可溶性。使用Bradford蛋白檢測法和QuantityOne軟件測定超聲上清液中蛋白總含量和融合蛋白占總蛋白比例,最后計(jì)算出上清液融合蛋白含量和Plectasin理論產(chǎn)量。1.4融合蛋白的提取通過離心獲得菌株,使用聲波降解法對菌株進(jìn)行破解,再通過離心獲得上清液并在過濾器中過濾。1.5融合蛋白的純化和切割使用鎳離子螯合層析法和幾丁質(zhì)親和層析法對破菌上清液中融合蛋白進(jìn)行純化。使用相應(yīng)的切割酶對純化的融合蛋白進(jìn)行切割,使用SDS-PAGE對切割結(jié)果進(jìn)行檢測。1.6切割產(chǎn)物Plectasin的確定使用SDS-PAGE對融合蛋白切割產(chǎn)物Plectasin進(jìn)行確定。2純化抗菌肽Plectasin體外活性實(shí)驗(yàn)2.1最終產(chǎn)物的純度分析融合蛋白SUMO-PS切割后獲得最終產(chǎn)物Plectasin經(jīng)過三甲基甘氨酸-十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(Tricine-SDS-PAGE)檢測和分子成像系統(tǒng)(Bio-Red Laboratories)分析以驗(yàn)證純度。2.2P lectasin抗菌活性檢測利用Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散法抗生素敏感性試驗(yàn)(K-B法)檢測Plectasin對MRSA、PRSP、VRE的抗菌活性。2.3 MIC和MBC測定通過制作懸菌液、制備抗菌肽在96孔平板上采用濃度稀釋法測定Plectasin的MIC和MBC。比較Plectasin和氨芐青霉素鈉(Amp)對不同細(xì)菌的MIC和MBC。2.4不同pH和溫度對Plectasin活性和穩(wěn)定的影響設(shè)置不同pH梯度(2.0、4.0、6.0、8.0、10.0)和不同溫度梯度(0、25、50、75、100℃),使用K-B方法觀察pH和溫度對Plectasi n抗菌活性和穩(wěn)定性的影響。3.抗菌肽Plectasin原核表達(dá)條件優(yōu)化的正交實(shí)驗(yàn)3.1 Plectasin融合表達(dá)基因的合成根據(jù)Mandal的研究獲得Plectasin氨基酸序列,基于大腸桿菌同義密碼子偏好性,設(shè)計(jì)優(yōu)化的Plectasin基因序列。Plectasin基因序列同分子伴侶SUMO的基因序列進(jìn)行重組,融合基因命名為SUMO-PS。3.2重組質(zhì)粒的構(gòu)建和識別融合基因SUMO-PS經(jīng)過相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶處理后,連接到經(jīng)過相同處理過的質(zhì)粒。重組的質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a菌株用于質(zhì)粒擴(kuò)增。通過PCR、雙酶切法和DNA測序確定重組質(zhì)粒成功構(gòu)建。3.3正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)選取誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間三個(gè)因素,并且在各個(gè)因素的3個(gè)水平設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)對表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。3.4融合蛋白優(yōu)化表達(dá)及定量按照已設(shè)計(jì)的正交試驗(yàn)對融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá),并使用15%SDS-PAGE對表達(dá)融合蛋白進(jìn)行檢測。使用標(biāo)準(zhǔn)SDS-PAGE法估算出到各組可溶融合蛋白的量。3.5數(shù)據(jù)分析使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,可得出三個(gè)主要因素誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間及誘導(dǎo)劑濃度的影響強(qiáng)度順序和優(yōu)化表達(dá)條件。[結(jié)果]1抗菌肽Plectasin高效原核表達(dá)菌株的構(gòu)建1.1重組質(zhì)粒的構(gòu)建瓊脂糖凝膠電泳顯示于156bp、140bp、159bp、141bp處出現(xiàn)特異條帶,證明重組質(zhì)粒pET-32a(+)-PS、pE-SUMO-PS、pTWIN1-C-PS、pGEX-5x-2-PS構(gòu)建成功,DNA測序也證明了四種重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。1.2融合蛋白的測定電泳結(jié)果顯示預(yù)期分子質(zhì)量(22kDa、24kDa、30kDa、30kDa)的四種蛋白在誘導(dǎo)后全菌蛋白中出現(xiàn),提示四種融合蛋白成功表達(dá)。重組菌株Origami-pET-32a(+)-PS、Origami-pE-SUMO-PS、Origami-pTWIN1-C-PS、Origami-pGEX-5x-2-PS破菌上清液中總蛋白含量分別為0.7200 g/L、0.5800 g/L、1.0880 g/L、0.7981 g/L；四種融合蛋白占上清液中總蛋白比例分別為24.06%、23.44%、16.04%、21.04%；上清液中四種融合蛋白含量分別為0.1732 g/L、0.1359g/L、0.1745g/L、 0.1708g/L; Plectasin理論產(chǎn)量分別為0.0356 g/L、0.0358 g/L、0.0238g/L、0.02 43g/L。1.3融合蛋白的純化和切割融合蛋白TrxA-PS切割產(chǎn)物電泳結(jié)果出現(xiàn)特異靶蛋白帶,但大多數(shù)融合蛋白未被完全切割； SUMO-PS切割產(chǎn)物電泳結(jié)果出現(xiàn)特異性靶蛋白條帶,部分融合蛋白未被完全切割。融合蛋白intein2-PS切割產(chǎn)物電泳結(jié)果出現(xiàn)特異性靶蛋白帶,但大多數(shù)融合蛋白未被完全切割。1.4最終產(chǎn)物的確定電泳結(jié)果顯示融合蛋白TrxA-PS、SUMO-PS、Intein2-PS經(jīng)切割后最終產(chǎn)物顯示特異條帶。2純化抗菌肽Plectasin體外活性實(shí)驗(yàn)2.1融合蛋白最終產(chǎn)物的純度分析根據(jù)Tricine-SDS-PAGE電泳結(jié)果,分子成像系統(tǒng)顯示獲得Plectasin的純度為98.3%。2.2 Plectasin抗菌活性檢測Plectasin對MRSA、PRSP、VRE均有抗菌活性。Amp對PRSP、VRE有抗菌活性,但對MRSA無抗菌活性。2.3 MIC和MBC測定Plecatsin對MRSA 1547111、MRSA 15471118、PRSP 31355、VRE的MIC分別64μg/ml(14μmol/L)、64μg/ml(14μmol/L).32μg/ml(7.3μmol/L)、64μg/ml(1 4μmol/L); Amp對MRSA 15471114. MRSA 15471118、PRSP 31355. VRE的MIC分別為64μg/ml(186μmol/L).128μg/ml(373μmol/L).16μg/ml(46μmol/L).3 2μg/ml(96μmol/L); Plecatsin對MRSA 15471114, MRSA 15471118、PRSP 313 55, VRE的MBC分別為64μg/ml(14μmol/L)、64μg/ml(14μmol/L)、32μg/ml(7.3 μmol/L)、64μg/ml(14μmol/L); Amp對MRSA 15471114、MRSA 15471118、PRSP 31355. VRE的MBC分別為64μg/ml(186μmol/L)、128μg/ml(373μmol/L)、1 ).32μg/ml(96μmol/L)。Plectasin和Amp對受檢臨床耐藥菌株的MIC和MBC有差異,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.4不同pH和溫度對Plectasin活性和穩(wěn)定性的影響在不同pH梯度下(2.0、4.0、6.0、8.0、10.0)和不同溫度梯度下(0、25、50、75、100℃),Plectasin顯示較強(qiáng)的活性和穩(wěn)定性。3抗菌肽P lectasin原核表達(dá)條件優(yōu)化的正交實(shí)驗(yàn)3.1重組質(zhì)粒的構(gòu)建PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示融合基因SUMO-PS被成功連接到載體上,DNA測序也證明了重組質(zhì)粒構(gòu)建成功3.2融合蛋白表達(dá)結(jié)果各實(shí)驗(yàn)組破解后全菌蛋白SDS-PAGE結(jié)果顯示在24kDa處均有特異蛋白條帶,表明融合蛋白成功表達(dá)。各實(shí)驗(yàn)組破菌上清SDS-PAGE結(jié)果顯示各實(shí)驗(yàn)組在24kDa處均有特異蛋白條帶,并且表達(dá)量有明顯差異。3.3融合蛋白表達(dá)定量標(biāo)準(zhǔn)SDS-PAGE法結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組4融合蛋白表達(dá)量是最高的,為142mg/L,實(shí)驗(yàn)組6表達(dá)量最低,為4.71mg/L,實(shí)驗(yàn)組5、8、9表達(dá)量也較高,分別為42.67mg/L.44mg/L.46.67mg/L。3.4數(shù)據(jù)分析使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析可得出影響因素強(qiáng)度由高到低分別為誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間及誘導(dǎo)劑濃度,而結(jié)果顯示優(yōu)化誘導(dǎo)條件為30℃、6h和0.05mmol/L IPTG。[結(jié)論]1本研究成功構(gòu)建Plectasin高效表達(dá)的重組大腸桿菌菌株Origami-pE-SUMO-PS和Origami-pET-32a(+)-PS。綜合融合蛋白的可溶性、切割效率、Plectasin理論產(chǎn)量等因素,SUMO和TrxA是Plectasin大腸桿菌融合表達(dá)理想分子伴侶；2重組大腸桿菌菌株Origami-pE-SUMO-PS表達(dá)的Plectasin對MRSA、PRSP、VRE均有抗菌活性；在不同溫度和pH條件下,Plectasin仍表現(xiàn)出良好的活性和穩(wěn)定性；3影響抗菌肽Plectasin在重組大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)融合表達(dá)的因素強(qiáng)度由強(qiáng)到弱分別為誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間及誘導(dǎo)劑濃度,優(yōu)化誘導(dǎo)條件為30℃、6h和0.O5mmol/L IPTG。
【關(guān)鍵詞】：Plectasin 分子伴侶 大腸桿菌 融合蛋白 抗菌活性 正交試驗(yàn)
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R3411;Q78
【目錄】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-23
• 第一章 抗菌肽Plectasin高效原核表達(dá)菌株的構(gòu)建23-42
• 第一節(jié) 引言23-24
• 第二節(jié) 材料與方法24-32
• 第三節(jié) 結(jié)果32-39
• 第四節(jié) 討論39-41
• 第五節(jié) 結(jié)論41-42
• 第二章 純化抗菌肽Plectasin體外活性實(shí)驗(yàn)42-52
• 第一節(jié) 引言42
• 第二節(jié) 材料與方法42-45
• 第三節(jié) 結(jié)果45-48
• 第四節(jié) 討論48-50
• 第五節(jié) 結(jié)論50-52
• 第三章 抗菌肽Plectasin原核表達(dá)條件優(yōu)化的正交試驗(yàn)52-63
• 第一節(jié) 引言52
• 第二節(jié) 材料與方法52-56
• 第三節(jié) 結(jié)果56-60
• 第四節(jié) 討論60-62
• 第五節(jié) 結(jié)論62-63
• 全文總結(jié)63-64
• 參考文獻(xiàn)64-70
• 英文縮寫略詞表70-71
• 成果71-73
• 致謝73-75

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 石慧;梁運(yùn)祥;;標(biāo)準(zhǔn)SDS-PAGE圖法測定大豆11S抗原蛋白含量的研究[J];飼料工業(yè);2011年07期

2 楊文理;陳守春;陳毅榮;覃揚(yáng);;TRAIL蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)研究[J];四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2006年05期

  本文關(guān)鍵詞：抗菌肽Plectasin高效原核表達(dá)菌株的構(gòu)建及表達(dá)條件優(yōu)化的正交試驗(yàn)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：354094