發(fā)布時間：2017-05-10 05:13

  本文關(guān)鍵詞：抗菌肽Plectasin高效原核表達菌株的構(gòu)建及表達條件優(yōu)化的正交試驗，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：[背景]隨著廣譜抗生素在臨床上的廣泛應(yīng)用,革蘭氏陽性球菌細菌耐藥性問題日益嚴峻,這增加了疾病治愈的難度并給患者和社會帶來了嚴重的經(jīng)濟負擔(dān)。細菌耐藥產(chǎn)生的原因是多方面的,其中抗菌藥物的廣泛使用和濫用最為主要�？股氐拈L期大量使用除了誘發(fā)細菌的廣泛耐藥之外,還會導(dǎo)致諸多不良反應(yīng)和毒副作用,如肝腎功能損害、血液和神經(jīng)系統(tǒng)毒性、胃腸道反應(yīng)等,這些不良反應(yīng)也同樣影響了敏感抗生素在治療耐藥革蘭陽性球菌感染中的選擇,因此開發(fā)新一代具有生物活性的抗菌物質(zhì)顯得尤為迫切和必要�？咕氖且环N具有高效抗菌、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)功能的多肽,是動物先天免疫的重要組成部分。研究表明：抗菌肽廣泛存在于各種生物體內(nèi),對細菌、真菌、病毒、原蟲甚至癌細胞都有不同程度的抑制和殺滅作用。與傳統(tǒng)抗生素相比,抗菌肽因作用機制獨特而不易產(chǎn)生耐藥性,部分抗菌肽還具備免疫調(diào)節(jié)活性。目前已有多種抗菌肽進入臨床試驗階段。美國Magainin公司開發(fā)的抗菌肽Pexiganan已成功應(yīng)用于臨床治療糖尿病足感染。2002年從腐生真菌中發(fā)現(xiàn)新型抗菌肽——菌絲霉素Plectasin,它對肺炎球菌、金黃色葡萄球菌及腸球菌,包括耐藥型的肺炎球菌和耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)都有良好的殺滅作用,且毒副作用非常小,這一發(fā)現(xiàn)顯示了Plectasin的強大的應(yīng)用潛力。生物體內(nèi)天然抗菌肽含量很低,直接分離純化步驟繁雜耗時,而通過化學(xué)合成的方法大量生產(chǎn)抗菌肽則價格昂貴,因此,尋找一種更具成本效益的生產(chǎn)方法成為抗菌肽產(chǎn)業(yè)化的又一關(guān)鍵點。隨著生物技術(shù)的逐步成熟和市場的需要呈上升趨勢,重組抗菌肽成為多肽類藥物產(chǎn)業(yè)化的主要方向之一。目前,大多數(shù)抗菌肽由像大腸桿菌表達系統(tǒng)這樣的原核表達系統(tǒng)表達,但使用大腸桿菌表達系統(tǒng)生產(chǎn)Plectasin目前報道較少。原核表達系統(tǒng)直接表達抗菌肽存在以下問題：1、大多數(shù)抗菌肽對大腸桿菌有抗菌活性；2、大多數(shù)表達蛋白以包涵體的形式存在；3、大腸桿菌缺乏翻譯后修飾和加工功能；4、表達的蛋白容易被蛋白酶降解；針對上述問題,目前通常采用融合表達策略來解決,利用不同功能的分子伴侶與抗菌肽在大腸桿菌中進行融合表達可以降低抗菌肽對宿主的毒害作用,提高表達蛋白可溶性和穩(wěn)定性,并且可以設(shè)計特定的裂解位點釋放抗菌肽。隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展,利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)抗菌肽不失為一種經(jīng)濟高效的方法。構(gòu)建高效重組大腸桿菌系統(tǒng)表達抗菌肽Plectasin,對表達的Plectasin進行體外活性檢測,并對其表達條件進行優(yōu)化,對推動針對耐藥革蘭陽性球菌感染的新型抗菌藥物——抗菌肽的研發(fā)具有積極意義。[目的]本實驗擬選取硫氧還蛋白(TrxA)、小泛素相關(guān)修飾物(SUMO)、內(nèi)含肽(Intein2)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)四種不同的分子伴侶分別構(gòu)建重組大腸桿菌菌株Origami-pET-32a(+)-PS、Origami-pE-SUMO-PS、Origami-pTWIN1-C-P S、Origami-pGEX-5x-2-PS對抗菌肽Plecatsin融合表達,綜合表達融合蛋白的可溶性、切割效率、Plectasin最終理論產(chǎn)量,篩選出合適的分子伴侶和高效的重組大腸桿菌菌株。利用實驗中獲得Plectasin進行體外抗菌活性實驗,觀察Plectasin對MRSA、耐萬古霉素腸球菌(VRE)、耐青霉素肺炎鏈球菌(PRSP)抗菌活性,測定Plectasin對不同細菌的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)。觀察Plectasin在不同pH和溫度條件下的活性和穩(wěn)定性。選取誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時間三個因素設(shè)計正交試驗,對Plectasin原核表達條件進行優(yōu)化,探索Plectasin原核表達的合適條件。最終為Plectasin進一步研究、生產(chǎn)及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。[方法]1抗菌肽Plectasin高效原核表達菌株的構(gòu)建1.1 Plectasin基因的修飾根據(jù)Mandal的研究獲得Plectasin氨基酸序列,基于大腸桿菌同義密碼子偏好性,設(shè)計優(yōu)化的Plectasin基因序列。Plectasin基因兩端分別添加相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶識別序列和切割酶識別序列。1.2重組質(zhì)粒的構(gòu)建和識別Plectasin修飾基因經(jīng)過相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶處理后,分別連接到經(jīng)過相同內(nèi)切酶處理過的質(zhì)粒構(gòu)成重組質(zhì)粒pGEX-5x-2-PS。Plectasin基因序列與TrxA、SUMO、Intein2、GST四種分子伴侶的基因序列分別進行重組,構(gòu)建融合表達基因,分別被命名為1rxA-PS、SUMO-PS、Intein2-PS、GST-PS。四種重組質(zhì)粒分別被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α菌株用于質(zhì)粒擴增。通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、雙酶切法和DNA測序確定重組質(zhì)粒成功構(gòu)建。1.3融合蛋白的測定重組質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Origami (DE3)菌株用于融合蛋白表達。經(jīng)誘導(dǎo)后,通過離心獲得菌株,用聲波降解法對菌株進行破解并離心獲得上層清液及沉淀。使用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分別檢測經(jīng)誘導(dǎo)的全菌蛋白、未經(jīng)誘導(dǎo)的全菌蛋白、破菌離心上清液和破菌離心沉淀中融合蛋白表達情況,確定融合蛋白的可溶性。使用Bradford蛋白檢測法和QuantityOne軟件測定超聲上清液中蛋白總含量和融合蛋白占總蛋白比例,最后計算出上清液融合蛋白含量和Plectasin理論產(chǎn)量。1.4融合蛋白的提取通過離心獲得菌株,使用聲波降解法對菌株進行破解,再通過離心獲得上清液并在過濾器中過濾。1.5融合蛋白的純化和切割使用鎳離子螯合層析法和幾丁質(zhì)親和層析法對破菌上清液中融合蛋白進行純化。使用相應(yīng)的切割酶對純化的融合蛋白進行切割,使用SDS-PAGE對切割結(jié)果進行檢測。1.6切割產(chǎn)物Plectasin的確定使用SDS-PAGE對融合蛋白切割產(chǎn)物Plectasin進行確定。2純化抗菌肽Plectasin體外活性實驗2.1最終產(chǎn)物的純度分析融合蛋白SUMO-PS切割后獲得最終產(chǎn)物Plectasin經(jīng)過三甲基甘氨酸-十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(Tricine-SDS-PAGE)檢測和分子成像系統(tǒng)(Bio-Red Laboratories)分析以驗證純度。2.2P lectasin抗菌活性檢測利用Kirby-Bauer紙片擴散法抗生素敏感性試驗(K-B法)檢測Plectasin對MRSA、PRSP、VRE的抗菌活性。2.3 MIC和MBC測定通過制作懸菌液、制備抗菌肽在96孔平板上采用濃度稀釋法測定Plectasin的MIC和MBC。比較Plectasin和氨芐青霉素鈉(Amp)對不同細菌的MIC和MBC。2.4不同pH和溫度對Plectasin活性和穩(wěn)定的影響設(shè)置不同pH梯度(2.0、4.0、6.0、8.0、10.0)和不同溫度梯度(0、25、50、75、100℃),使用K-B方法觀察pH和溫度對Plectasi n抗菌活性和穩(wěn)定性的影響。3.抗菌肽Plectasin原核表達條件優(yōu)化的正交實驗3.1 Plectasin融合表達基因的合成根據(jù)Mandal的研究獲得Plectasin氨基酸序列,基于大腸桿菌同義密碼子偏好性,設(shè)計優(yōu)化的Plectasin基因序列。Plectasin基因序列同分子伴侶SUMO的基因序列進行重組,融合基因命名為SUMO-PS。3.2重組質(zhì)粒的構(gòu)建和識別融合基因SUMO-PS經(jīng)過相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶處理后,連接到經(jīng)過相同處理過的質(zhì)粒。重組的質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a菌株用于質(zhì)粒擴增。通過PCR、雙酶切法和DNA測序確定重組質(zhì)粒成功構(gòu)建。3.3正交試驗設(shè)計選取誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時間三個因素,并且在各個因素的3個水平設(shè)計正交試驗對表達條件進行優(yōu)化。3.4融合蛋白優(yōu)化表達及定量按照已設(shè)計的正交試驗對融合蛋白誘導(dǎo)表達,并使用15%SDS-PAGE對表達融合蛋白進行檢測。使用標準SDS-PAGE法估算出到各組可溶融合蛋白的量。3.5數(shù)據(jù)分析使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對本實驗數(shù)據(jù)進行分析,可得出三個主要因素誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時間及誘導(dǎo)劑濃度的影響強度順序和優(yōu)化表達條件。[結(jié)果]1抗菌肽Plectasin高效原核表達菌株的構(gòu)建1.1重組質(zhì)粒的構(gòu)建瓊脂糖凝膠電泳顯示于156bp、140bp、159bp、141bp處出現(xiàn)特異條帶,證明重組質(zhì)粒pET-32a(+)-PS、pE-SUMO-PS、pTWIN1-C-PS、pGEX-5x-2-PS構(gòu)建成功,DNA測序也證明了四種重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。1.2融合蛋白的測定電泳結(jié)果顯示預(yù)期分子質(zhì)量(22kDa、24kDa、30kDa、30kDa)的四種蛋白在誘導(dǎo)后全菌蛋白中出現(xiàn),提示四種融合蛋白成功表達。重組菌株Origami-pET-32a(+)-PS、Origami-pE-SUMO-PS、Origami-pTWIN1-C-PS、Origami-pGEX-5x-2-PS破菌上清液中總蛋白含量分別為0.7200 g/L、0.5800 g/L、1.0880 g/L、0.7981 g/L；四種融合蛋白占上清液中總蛋白比例分別為24.06%、23.44%、16.04%、21.04%；上清液中四種融合蛋白含量分別為0.1732 g/L、0.1359g/L、0.1745g/L、 0.1708g/L; Plectasin理論產(chǎn)量分別為0.0356 g/L、0.0358 g/L、0.0238g/L、0.02 43g/L。1.3融合蛋白的純化和切割融合蛋白TrxA-PS切割產(chǎn)物電泳結(jié)果出現(xiàn)特異靶蛋白帶,但大多數(shù)融合蛋白未被完全切割； SUMO-PS切割產(chǎn)物電泳結(jié)果出現(xiàn)特異性靶蛋白條帶,部分融合蛋白未被完全切割。融合蛋白intein2-PS切割產(chǎn)物電泳結(jié)果出現(xiàn)特異性靶蛋白帶,但大多數(shù)融合蛋白未被完全切割。1.4最終產(chǎn)物的確定電泳結(jié)果顯示融合蛋白TrxA-PS、SUMO-PS、Intein2-PS經(jīng)切割后最終產(chǎn)物顯示特異條帶。2純化抗菌肽Plectasin體外活性實驗2.1融合蛋白最終產(chǎn)物的純度分析根據(jù)Tricine-SDS-PAGE電泳結(jié)果,分子成像系統(tǒng)顯示獲得Plectasin的純度為98.3%。2.2 Plectasin抗菌活性檢測Plectasin對MRSA、PRSP、VRE均有抗菌活性。Amp對PRSP、VRE有抗菌活性,但對MRSA無抗菌活性。2.3 MIC和MBC測定Plecatsin對MRSA 1547111、MRSA 15471118、PRSP 31355、VRE的MIC分別64μg/ml(14μmol/L)、64μg/ml(14μmol/L).32μg/ml(7.3μmol/L)、64μg/ml(1 4μmol/L); Amp對MRSA 15471114. MRSA 15471118、PRSP 31355. VRE的MIC分別為64μg/ml(186μmol/L).128μg/ml(373μmol/L).16μg/ml(46μmol/L).3 2μg/ml(96μmol/L); Plecatsin對MRSA 15471114, MRSA 15471118、PRSP 313 55, VRE的MBC分別為64μg/ml(14μmol/L)、64μg/ml(14μmol/L)、32μg/ml(7.3 μmol/L)、64μg/ml(14μmol/L); Amp對MRSA 15471114、MRSA 15471118、PRSP 31355. VRE的MBC分別為64μg/ml(186μmol/L)、128μg/ml(373μmol/L)、1 ).32μg/ml(96μmol/L)。Plectasin和Amp對受檢臨床耐藥菌株的MIC和MBC有差異,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2.4不同pH和溫度對Plectasin活性和穩(wěn)定性的影響在不同pH梯度下(2.0、4.0、6.0、8.0、10.0)和不同溫度梯度下(0、25、50、75、100℃),Plectasin顯示較強的活性和穩(wěn)定性。3抗菌肽P lectasin原核表達條件優(yōu)化的正交實驗3.1重組質(zhì)粒的構(gòu)建PCR擴增結(jié)果顯示融合基因SUMO-PS被成功連接到載體上,DNA測序也證明了重組質(zhì)粒構(gòu)建成功3.2融合蛋白表達結(jié)果各實驗組破解后全菌蛋白SDS-PAGE結(jié)果顯示在24kDa處均有特異蛋白條帶,表明融合蛋白成功表達。各實驗組破菌上清SDS-PAGE結(jié)果顯示各實驗組在24kDa處均有特異蛋白條帶,并且表達量有明顯差異。3.3融合蛋白表達定量標準SDS-PAGE法結(jié)果顯示實驗組4融合蛋白表達量是最高的,為142mg/L,實驗組6表達量最低,為4.71mg/L,實驗組5、8、9表達量也較高,分別為42.67mg/L.44mg/L.46.67mg/L。3.4數(shù)據(jù)分析使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析可得出影響因素強度由高到低分別為誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時間及誘導(dǎo)劑濃度,而結(jié)果顯示優(yōu)化誘導(dǎo)條件為30℃、6h和0.05mmol/L IPTG。[結(jié)論]1本研究成功構(gòu)建Plectasin高效表達的重組大腸桿菌菌株Origami-pE-SUMO-PS和Origami-pET-32a(+)-PS。綜合融合蛋白的可溶性、切割效率、Plectasin理論產(chǎn)量等因素,SUMO和TrxA是Plectasin大腸桿菌融合表達理想分子伴侶；2重組大腸桿菌菌株Origami-pE-SUMO-PS表達的Plectasin對MRSA、PRSP、VRE均有抗菌活性；在不同溫度和pH條件下,Plectasin仍表現(xiàn)出良好的活性和穩(wěn)定性；3影響抗菌肽Plectasin在重組大腸桿菌表達系統(tǒng)融合表達的因素強度由強到弱分別為誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時間及誘導(dǎo)劑濃度,優(yōu)化誘導(dǎo)條件為30℃、6h和0.O5mmol/L IPTG。
【關(guān)鍵詞】：Plectasin 分子伴侶 大腸桿菌 融合蛋白 抗菌活性 正交試驗
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R3411;Q78
【目錄】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-23
• 第一章 抗菌肽Plectasin高效原核表達菌株的構(gòu)建23-42
• 第一節(jié) 引言23-24
• 第二節(jié) 材料與方法24-32
• 第三節(jié) 結(jié)果32-39
• 第四節(jié) 討論39-41
• 第五節(jié) 結(jié)論41-42
• 第二章 純化抗菌肽Plectasin體外活性實驗42-52
• 第一節(jié) 引言42
• 第二節(jié) 材料與方法42-45
• 第三節(jié) 結(jié)果45-48
• 第四節(jié) 討論48-50
• 第五節(jié) 結(jié)論50-52
• 第三章 抗菌肽Plectasin原核表達條件優(yōu)化的正交試驗52-63
• 第一節(jié) 引言52
• 第二節(jié) 材料與方法52-56
• 第三節(jié) 結(jié)果56-60
• 第四節(jié) 討論60-62
• 第五節(jié) 結(jié)論62-63
• 全文總結(jié)63-64
• 參考文獻64-70
• 英文縮寫略詞表70-71
• 成果71-73
• 致謝73-75

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

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  本文關(guān)鍵詞：抗菌肽Plectasin高效原核表達菌株的構(gòu)建及表達條件優(yōu)化的正交試驗，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：354094