本文關(guān)鍵詞：MASP-2 CUB1和CUB2功能區(qū)蛋白抗體制備及初步鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：補(bǔ)體系統(tǒng)作為機(jī)體固有免疫防御的重要部分,是具有精密調(diào)控機(jī)制的蛋白質(zhì)反應(yīng)系統(tǒng)。而甘露聚糖結(jié)合凝集素相關(guān)絲氨酸蛋白酶2(mannan-binding lectin associated serine protease-2,MASP-2)作為激活補(bǔ)體凝集素途徑的重要參與者,具有極為重要的生物學(xué)意義。MASP-2的缺乏或功能障礙可能導(dǎo)致長(zhǎng)期性易發(fā)感染,與腫瘤和自身免疫性疾病的發(fā)生及發(fā)展也存在關(guān)聯(lián)。機(jī)體在甘露聚糖結(jié)合凝集素(mannose-binding lectin,MBL)識(shí)別并結(jié)合病原體后,激活補(bǔ)體凝集素途徑。此時(shí)MASP-2分子中絲氨酸蛋白酶區(qū)域的精氨酸-異亮氨酸間的肽鍵裂解并產(chǎn)生自激活作用,進(jìn)而引發(fā)后續(xù)反應(yīng)。MASP-2分子由6個(gè)功能區(qū)片段組成,CUB結(jié)構(gòu)域是在補(bǔ)體成分C1r/C1s、Uegf和骨髓多態(tài)形成蛋白(b?o?n?e??m?o?r?p?h?o?g?e?n?e?t?i?c protein 1,bmp1)中發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)域。CUB1-EGF與MASP-2同源二聚體形成相關(guān),CUB1-EGF-CUB2與MBL結(jié)合相關(guān),并決定其是否能夠被活化。本實(shí)驗(yàn)擬在分別成功構(gòu)建CUB1及CUB2原核重組表達(dá)載體的基礎(chǔ)上,應(yīng)用異丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白,經(jīng)純化后免疫適齡雌性BALB/c小鼠,制備高特異性的多克隆抗體,以期為后續(xù)檢測(cè)體液MASP-2含量、構(gòu)建以多克隆抗體為基礎(chǔ)的臨床輔助診斷乃至治療奠定基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)將CUB1及CUB2基因片段通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增所獲得的產(chǎn)物經(jīng)純化后以BamH I、Not I進(jìn)行雙酶切,繼而切膠回收,經(jīng)DNA連接酶連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-6P-2-CUB1及pGEX-6P-2-CUB2,分別將攜帶CUB1、CUB2基因片段的pGEX-6P-2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞,并將菌液涂布于LB選擇性固體培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性克隆,獲得的陽(yáng)性克隆經(jīng)過(guò)驗(yàn)證后取單一菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)14~16小時(shí)。擴(kuò)大培養(yǎng)至A600于0.8~1.0之間,加入IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。離心后棄除上清液并充分洗滌菌體沉淀后,在冰浴條件下進(jìn)行超聲裂解,分別取裂解后上清液和沉淀制備樣本進(jìn)行SDS-PAGE,分析融合蛋白所在組分。GST-CUB1及GST-CUB2蛋白均以包涵體形式存在,利用高濃度尿素變性,梯度復(fù)性后純化融合蛋白。將純化后的融合蛋白作為抗原,與Freund佐劑充分混合后免疫5周齡BALB/c雌性小鼠,此后分別于第1天、第14天及第28天進(jìn)行腹腔免疫注射,于末次免疫后一周后取血,分離血清后保存于-80℃環(huán)境。應(yīng)用Western blot檢測(cè)多克隆抗體特異性,應(yīng)用間接酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)多克隆抗體效價(jià):CUB1抗體效價(jià)達(dá)1∶32 000,CUB2抗體效價(jià)大于1∶16 000。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)已分別獲得效價(jià)高、特異性強(qiáng)的CUB1及CUB2多克隆抗體。
【關(guān)鍵詞】：MASP-2 CUB1 CUB2 融合蛋白表達(dá) 多克隆抗體制備
【學(xué)位授予單位】：河北北方學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R392
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-11
• 英文縮寫(xiě)11-13
• 前言13-15
• 實(shí)驗(yàn)儀器及材料15-20
• 實(shí)驗(yàn)方法與步驟20-32
• 結(jié)果32-34
• 附圖34-42
• 附表42-43
• 討論43-46
• 結(jié)論46-47
• 參考文獻(xiàn)47-51
• 綜述51-61
• 參考文獻(xiàn)55-61
• 致謝61-62
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷62

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 賈天軍,李萍,張庶民;MASPs的結(jié)構(gòu)與功能研究現(xiàn)狀[J];醫(yī)學(xué)綜述;2003年04期

2 Yanping Shi;Geling Liu;Huiqin Zhang;Fang Yu;Xiuxiu Xiang;Yifang Lu;Xiaomei Dong;Xiaohua Li;;甲狀腺腫瘤患者血清中MBL和MASP-2的表達(dá)水平及其意義(英文)[J];The Chinese-German Journal of Clinical Oncology;2013年03期

  本文關(guān)鍵詞：MASP-2 CUB1和CUB2功能區(qū)蛋白抗體制備及初步鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號(hào)：352260