目的:研究血紅素加氧酶1（Heme oxygenase 1,Hmox1）對骨形態(tài)發(fā)生蛋白9（Bone Morphogenetic Protein 9,BMP9）誘導的間充質干細胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）C3H10T1/2向成骨及成脂雙向分化的影響及可能機制。方法:腺病毒Ad-BMP9感染C3H10T1/2,熒光定量PCR（q PCR）檢測Hmox家族中Hmox1的基因表達變化,再用Western Blot檢測HMOX1蛋白表達。用Hmox1的激動劑COPP和抑制劑ZNPP分別同BMP9共同處理C3H10T1/2,堿性磷酸酶（ALP）染色以及定量分析和茜素紅S染色檢測Hmox1對BMP9誘導的C3H10T1/2成骨分化的影響,油紅O染色檢測Hmox1對BMP9誘導的C3H10T1/2成脂分化的影響。構建過表達Hmox1的腺病毒（Ad-Hmox1）,q PCR和Western Blot驗證Ad-Hmox1的有效性。Ad-Hmox1與BMP9處理C3H10T1/2,ALP染色和定量分析檢測成骨早期指標,q PCR檢測相關轉錄因子Runx2、Dlx5、Id1、... 

【文章來源】：重慶醫(yī)科大學重慶市

【文章頁數】：49 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

BMP9對Hmox1表達的影響

18圖 2. COPP、ZNPP 對 BMP9 誘導下的成骨分化的影響Fig 2. The effect of COPP and ZNPP on the osteogenic differentiation induced by BMP9(A)(B) BMP9-induced ALP activity was increased after treatment of COPP while decreasedafter treatment of ZNPP. (C) BMP9-induced calcium deposition was promoted after treatment ofCOPP while decreased after treatment of ZNPP at 14d and 21d. *p<0.05, ***p<0.0012.3 COPP、ZNPP 對 BMP9 誘導的 C3H10T1/2 成脂分化的影響30 M COPP 或 10 M ZNPP 處理細胞 24h，加入 BMP9 條件培養(yǎng)基，于第 14d、25d 進行油紅 O 染色，觀察脂滴形成情況。結果顯示： COPP 使 BMP9 誘導的脂滴形成減少而 ZNPP 使脂滴形成增多（圖 3）。

圖 3. COPP、ZNPP 對 BMP9 誘導的 C3H10T1/2 成脂分化的影響Fig 3. The effect of COPP and ZNPP on the adipogenic differentiation induced by BMP9COPP inhibited while ZNPP increased lipid droplets induced by BMP9 at 14d and 25d.2.4 Hmox1 過表達質粒的構建和腺病毒包裝、有效性驗證高保真 PCR 擴增 Hmox1 基因的編碼序列，電泳結果顯示 800bp 左右的目的條帶，將酶切的載體和目的片段連接后轉入 DH10B，挑菌做菌落 PCR，陽性條帶在 500bp 左右（圖 4A）；PmeⅠ線性化測序正確的質粒，電轉入 BJeasy 進行同源重組，PacⅠ酶切重組質粒，釋放出 30kb 的大片段和 4kb 左右的小片段（圖 4B）；經 lipo 2000 轉染進 HEK293 細胞中，第 3 天表達紅色熒光，第 5 天熒光表達增多，提示腺病毒包裝成功（圖 4C）；用擴增到一定滴度的病毒感染 C3H10T1/2 細胞，在第 3 天收集蛋白做 Western Blot，結果顯示 Hmox1 蛋白表達增加（圖 4D）。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]血紅素氧化酶1在ADSCs增殖、凋亡和成骨分化的作用[J]. 陳曉鵬,胡永成,方成,張麗娟,張榮信,黃文敬.  天津醫(yī)科大學學報. 2015(05)
[2]血紅素加氧酶1在骨髓間充質干細胞中抗凋亡作用研究[J]. 白海,王存邦,張玲,馬曉慧,葸瑞,張茜,周進茂.  中華醫(yī)學雜志. 2012 (32)



本文編號：3511281