目的:以小鼠胸腺上皮細胞系mTEC1（mouse thymic epithelial cell line 1,mTEC1）為研究對象,探討Notch信號、mTOR信號在胸腺退化和衰老中的作用和機制,為進一步闡明胸腺衰老和退化的機制,預防和治療胸腺退化引起的T細胞免疫缺陷奠定基礎。方法:1.采用GM-CSF+IL-4誘導小鼠骨髓來源的樹突狀細胞（bone marrow derived dendritic cells,BMDCs）,并以LPS活化BMDCs,檢測其表面Jagged1表達水平。將活化的BMDCs與mTEC1進行共培養(yǎng)和Transwell培養(yǎng),以β-半乳糖苷酶染色,western blot檢測p21等細胞衰老相關指標觀察mTEC1衰老情況。2.用重組Jagged1蛋白替代活化的BMDCs與mTEC1細胞共培養(yǎng),并采用Notch抑制劑DAPT處理與重組Jagged1蛋白共培養(yǎng)的mTEC1;或將Notch3胞內活化片段NICD3慢病毒載體轉染mTEC1,以β-半乳糖苷酶染色,western blot檢測p21等細胞衰老相關指標,觀察Jagged1/Notch信號活化誘導mTEC1衰... 

【文章來源】：江蘇大學江蘇省

【文章頁數(shù)】：93 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略表
第一章 緒論
    1.1 胸腺
        1.1.1 胸腺上皮細胞與T細胞的發(fā)育
        1.1.2 胸腺退化
    1.2 Notch信號通路
        1.2.1 Notch的受體和配體
        1.2.2 Notch的受體和配體在胸腺組織細胞中的分布
        1.2.3 Notch信號通路的激活
    1.3 mTOR信號通路
        1.3.1 mTORC1信號通路
        1.3.2 mTORC2信號通路
    1.4 Notch與mTOR信號途徑的相互關系
第二章 研究目的、內容、方法、實驗設計和意義
    2.1 研究目的
    2.2 研究內容
    2.3 研究方法
    2.4 實驗設計方案
        2.4.1 驗證活化BMDCs誘導胸腺上皮細胞系m TEC1衰老
        2.4.2 體外驗證重組Jagged1蛋白誘導小鼠胸腺上皮細胞系m TEC1衰老
        2.4.3 活化或抑制mTOR信號觀察胸腺上皮細胞系m TEC1中Notch信號、Foxn1以及其他衰老標志物變化情況
        2.4.4 活化或抑制Notch信號觀察胸腺上皮細胞系m TEC1中mTOR信號、Foxn1以及其他衰老標志物變化情況
    2.5 研究意義
第三章 實驗材料和方法
    3.1 試劑與耗材
        3.1.1 試劑
        3.1.2 主要儀器和耗材
        3.1.3 主要試劑的配制
    3.2 實驗方法
        3.2.1 細胞培養(yǎng)
            3.2.1.1 胸腺上皮細胞系m TEC1的培養(yǎng)
            3.2.1.2 人源胚胎腎細胞HEK-293T細胞的培養(yǎng)
        3.2.2 小鼠骨髓來源的樹突狀細胞（BMDCs）的誘導
            3.2.2.1 小鼠骨髓細胞的獲取
            3.2.2.2 小鼠BMDCs的體外誘導
            3.2.2.3 流式細胞術檢測BMDCs的活化后表面標志的改變
        3.2.3 β-半乳糖苷酶染色
        3.2.4 免疫熒光染色分析m TEC1表面標志
        3.2.5 Western blot檢測不同處理的m TEC1衰老相關蛋白表達
            3.2.5.1 細胞總蛋白的提取
            3.2.5.2 BCA調整蛋白濃度
            3.2.5.3 Western blot
        3.2.6 小鼠Raptor-sh RNA慢病毒載體的構建、包裝、感染和鑒定
            3.2.6.1 DH5α 感受態(tài)細胞的制備
            3.2.6.2 Raptor-sh RNA慢病毒載體的構建、包裝、感染和鑒定
        3.2.7 Rictor-sh RNA慢病毒載體的構建、包裝、感染和鑒定
        3.2.8 NICD3慢病毒表達載體擴增、轉染、包裝和感染
        3.2.9 Notch信號與m TEC1衰老相關性研究
            3.2.9.1 活化的BMDCs誘導m TEC1衰老
            3.2.9.2 重組蛋白Jagged1蛋白誘導m TEC1衰老
            3.2.9.3 NICD3慢病毒感染誘導m TEC1的衰老
            3.2.9.4 Notch抑制劑DAPT抑制Jagged1誘導的m TEC1的衰老
        3.2.10 Notch信號與mTOR交互對話對m TEC1衰老的影響
            3.2.10.1 Rapamycin抑制mTOR信號對Jagged1誘導m TEC1衰老的調節(jié)
            3.2.10.2 Sh RNA敲降TSC2基因激活mTORC對Jagged1誘導m TEC1衰老的調節(jié)
            3.2.10.3 Sh RNA敲降Raptor基因抑制mTORC1對Jagged1誘導m TEC1衰老的調節(jié)
            3.2.10.4 Sh RNA敲降Rictor基因抑制mTORC2對Jagged1誘導m TEC1衰老的調節(jié)
            3.2.10.5 轉染NICD3激活Notch信號對mTORC1信號及m TEC1衰老的影響
            3.2.10.6 DAPT抑制Notch信號對mTORC1信號及m TEC1衰老的影響
    3.3 統(tǒng)計學分析
第四章 實驗結果及討論
    4.1 Notch信號途徑活化誘導m TEC1衰老
        4.1.1 活化的BMDCs上調表達Jagged1及成熟標志
        4.1.2 活化的BMDCs通過直接接觸誘導m TEC1衰老
        4.1.3 活化的BMDCs間接接觸（Transwell）不能誘導m TEC1衰老
        4.1.4 重組Jagged1蛋白誘導m TEC1的衰老
        4.1.5 NICD3慢病毒感染誘導m TEC1的衰老
        4.1.6 Notch抑制劑DAPT抑制Jagged1誘導的m TEC1的衰老
    4.2 mTORC1與Notch信號交互對話促進m TEC1衰老
        4.2.1 Rapamycin抑制mTOR信號部分逆轉Jagged1誘導的m TEC1衰老
        4.2.2 Sh RNA敲降TSC2基因，mTOR信號高度活化，促進Jagged1誘導的m TEC1衰老
        4.2.3 Sh RNA敲降Raptor基因，抑制mTORC1，部分逆轉Jagged1誘導的m TEC1衰老
        4.2.4 mTORC2不參與Jagged1/Notch誘導的m TEC1的衰老
        4.2.5 轉染NICD3，活化Notch信號，上調mTOR信號，促進m TEC1的衰老
        4.2.6 DAPT阻斷Notch信號，負向調控mTOR，抑制Jagged1誘導的m TEC1衰老
    4.3 討論
第五章 結論與展望
    5.1 主要結論
    5.2 展望
參考文獻
文獻綜述 mTOR信號通路與免疫細胞及自身免疫病
    1.mTOR信號通路的組成與活化
    2.mTOR與樹突狀細胞（DCs）
    3.mTOR與T細胞
    4.mTOR與自身免疫性疾病
    參考文獻
致謝
攻讀碩士學位期間發(fā)表的文章及參加的會議



本文編號：3483686