本文關(guān)鍵詞：超抗原SEB疫苗rS-H的研制及其免疫效果研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：金黃色葡萄球菌是引起人類食物中毒、軟組織與骨組織感染以及致命性中毒性休克中的罪魁禍?zhǔn)?這種常見的細(xì)菌可以合成包括金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)在內(nèi)的多種多樣的毒力因子,該超抗原在皮摩爾濃度水平下就能夠直接與抗原遞呈細(xì)胞上的II類主要組織相容性復(fù)合體分子(MHC II)以及T細(xì)胞受體(TCR)Vβ區(qū)域上的特異性結(jié)構(gòu)域直接相連接,快速并過量激活感染者的免疫系統(tǒng)引起各種炎癥因子以及趨化因子的大量釋放并且最終導(dǎo)致高燒、急性肺損傷、急性呼吸困難、多器官衰竭以及致死性休克等威脅生命安全的癥狀。針對(duì)超抗原的治療得到了世界范圍內(nèi)的關(guān)注,多種基于抗體、疫苗以及其它小分子的治療研究已經(jīng)展開。本研究采用分子克隆的方法將修改過TCR Vβ結(jié)合區(qū)的SEB基因(rSEB)與結(jié)核分枝桿菌熱休克蛋白65(HSP65)基因融合,構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-rS-H,經(jīng)表達(dá)成功獲得一種新型的SEB重組疫苗rS-H。在對(duì)表達(dá)及純化工藝進(jìn)行優(yōu)化后得出:通過對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化,將目的蛋白的表達(dá)量提高了約15%;通過對(duì)包涵體洗滌條件、包涵體裂解條件以及包涵體復(fù)性條件的優(yōu)化將粗純品中目的蛋白的純度提高約40%;通過對(duì)金屬螯合層析的上樣流速以及Q陰離子交換層析的梯度洗脫長(zhǎng)度進(jìn)行優(yōu)化,重組蛋白的純度可以提高到90%以上,最終收率可以提高到45%以上。在對(duì)該疫苗的免疫效果進(jìn)行考察中發(fā)現(xiàn):經(jīng)過3次皮下免疫小鼠后,通過對(duì)抗SEB特異性抗體效價(jià)結(jié)果、攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)保護(hù)率及抗體體外中和試驗(yàn)結(jié)果的分析,重組蛋白rS-H成功誘導(dǎo)了體液免疫應(yīng)答,抗SEB特異性抗體效價(jià)最高值接近215,顯著高于其他疫苗對(duì)照組(P0.01);r S-H疫苗在5×LD50毒素劑量以及2×LD50毒素劑量攻毒后保護(hù)率分別達(dá)到80%(i.n.)與90%(i.p.),高于其它疫苗對(duì)照組;并且有效緩解攻毒后引起的肺部、心臟以及腎臟組織的出血情況與病變情況;在LD50與LD10劑量下分別經(jīng)腹腔與滴鼻攻毒后,rS-H疫苗組可以抑制各細(xì)胞因子的升高,顯著低于陰性對(duì)照組(P0.01);體外攻毒實(shí)驗(yàn)中,rS-H疫苗組誘導(dǎo)的特異性抗體可以有效中和SEB毒素并且抑制SEB引起的各炎癥細(xì)胞因子升高,各細(xì)胞因子水平顯著低于對(duì)照組(P0.05)。以上結(jié)果表明,本研究制備的rS-H可以有效引起體液免疫應(yīng)答,成功誘導(dǎo)抗SEB抗體,并且在攻毒后可以有效緩解SEB引起的癥狀。
【關(guān)鍵詞】：超抗原 SEB 重組蛋白 原核表達(dá) 體液免疫
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第1章 緒論11-33
• 1.1 金黃色葡萄球菌11-12
• 1.2 SEs的超抗原性質(zhì)12-14
• 1.3 超抗原相關(guān)信號(hào)通路14-19
• 1.4 超抗原與細(xì)胞應(yīng)答19-21
• 1.5 SEs相關(guān)腸胃疾病21-23
• 1.6 SEB作為生物戰(zhàn)劑應(yīng)用的潛能23-24
• 1.7 超抗原休克小鼠模型24-26
• 1.8 超抗原的治療策略26-30
• 1.9 結(jié)核分枝桿菌熱休克蛋白30-33
• 第2章 融合蛋白rS-H的表達(dá)及純化33-58
• 2.1 材料、儀器及溶液配制方法33-35
• 2.1.1 材料33
• 2.1.2 儀器33-34
• 2.1.3 溶液配制34-35
• 2.2 試驗(yàn)方法35-47
• 2.2.1 原核表達(dá)載體pET-28a-rS-H的構(gòu)建35-41
• 2.2.2 融合蛋白rS-H的表達(dá)、粗純及相關(guān)工藝優(yōu)化41-44
• 2.2.3 融合蛋白rS-H的精純及其相關(guān)工藝優(yōu)化44-47
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果47-56
• 2.3.1 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-rS-H的鑒定47-49
• 2.3.2 誘導(dǎo)表達(dá)條件及包涵體蛋白 rS-H 粗純工藝條件優(yōu)化結(jié)果49-52
• 2.3.3 融合蛋白rS-H精純及相關(guān)優(yōu)化結(jié)果52-56
• 2.4 討論56-58
• 第3章 融合蛋白rS-H的體液免疫效果研究58-73
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料、儀器及溶液配制58-59
• 3.1.1 材料58
• 3.1.2 儀器58-59
• 3.1.3 溶液配制59
• 3.2 方法59-63
• 3.2.1 體液免疫分組以及時(shí)間安排59-61
• 3.2.2 腹腔攻毒及滴鼻攻毒模型毒素LD50的測(cè)定61
• 3.2.3 SEB體內(nèi)攻毒保護(hù)方案設(shè)計(jì)61-62
• 3.2.4 體外抗體中和試驗(yàn)62-63
• 3.3 結(jié)果63-71
• 3.3.1 抗SEB特異性抗體滴度測(cè)定結(jié)果63-65
• 3.3.2 腹腔攻毒試驗(yàn)與滴鼻攻毒實(shí)驗(yàn)LD50測(cè)定結(jié)果65
• 3.3.3 SEB+LPS體內(nèi)攻毒保護(hù)結(jié)果65-69
• 3.3.4 體外抗體中和保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果69-70
• 3.3.5 組織病理切片分析結(jié)果70-71
• 3.4 討論71-73
• 第4章 結(jié)論73-74
• 致謝74-75
• 參考文獻(xiàn)75-80

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